Determination of RT-PCR detection limit of live and dead Salmonella cells in raw and sterilized milk

هدف از انجام اين مطالعه تعيين محدوده تشخيصي روش RT-PCR جهت تشخيص سالمونلاي زنده و مرده در شير خام و استريليزه بود. در ابتدا ميکروارگانيزم در محيط کشت TSB، شير خام و شير استريليزه تلقيح و نمونه‌ها به دو بخش تقسيم شدند. در هر تيمار يکي از نمونه‌ها براي غير فعال شدن باکتري مدت 10 دقيقه در دماي 80 درجه سانتيگراد حرارت داده شدند. از هر نمونه دو سري رقت سازي ده دهي تهيه و يکي مستقيما و ديگري بعد از 4 ساعت گرمخانه‌گذاري در دماي 37 درجه سانتيگراد مورد آزمايش PCR معمولي و RT-PCR قرار گرفتند. در نمونه‌هاي TSB، شير خام و شير استريليزه حرارت داده شده و نشده غني‌ سازي شده يا نشده محدوده تشخيص باکتري ژن invA با روش PCR معمولي به ترتيب 100 × 5، 104 × 1 و 103 × 1 واحد تشکيل دهنده کلني در ميلي‌ليتر بود. حساسيت روش RT-PCR در نمونه‌هاي حرارت نديده و غني سازي شده نيز به ترتيب 100 × 5، 104 × 1 و 103 × 1 واحد تشکيل دهنده کلني در ميلي‌ليتر بود. با روش RT-PCR در هيچکدام از نمونه‌هاي حرارت ديده باکتري تشخيص داده نشد. نتايج اين آزمايش يکي از کاربردهاي مهم RT-PCR جهت شناسايي باکتري زنده از مرده و تعيين محدوده تشخيصي سالمونلا را در شير مشخص نمود.

The objective of the current study was to evaluate the reproducibility of a reverse transcriptase PCR (RT-PCR)-based technique to differentiate viable and dead Salmonella cells in raw and sterilized milk. The microorganism was initially inoculated into the milk samples followed by incubating at 37 C for 4 h prior to inactivation by heat at 80 C for 10 min. The treated and non-treated samples were subsequently monitored using both PCR and RT-PCR, in vitro. Following 4 h incubation, the invA gene of Salmonella was clearly amplified by RT-PCR, while no band was detected in the heated samples. On the other hand, using the conventional PCR, it was possible to amplify the gene in both samples. Our results may suggest an important application of the RT-PCR technique, especially when the number of live organisms is an imperative factor to produce food borne infections and to establish a detection limit of the test.