تعيين دوزاژ ژن آسپارتيك پروتئاز در ژنوم آنكوسركا ولولوس

آسپارتيك پروتئازها گروه نسبتا كوچكي از آنزيم‌ها مي‌باشند كه در نماتودهاي متفاوتي از جمله آنكوسركا ولولوس بيان مي‌شوند. در اين تحقيق، يك گمانه زني در مورد تعداد نسخه‌هاي ژن مربوط به كلون OV7A در يك گونه نزديك به آنكوسركا ولولوس به نام آنكوسركا گيبسوني صورت مي‌گيرد. اين كار به كمك روش بلوتينگ شكافي انجام مي‌شود. كلون OV7A حاوي يك cDNA كد كننده مربوط به دو سوم از كل ناحيه كد شونده پروتيئن آسپارتيك پروتئاز آنكوسركا ولولوس مي‌باشد. به منظور انجام هيبريداسيون، ميزان معيني از رقت‌هاي سريالي مربوط به DNA ژنومي و DNA پلاسميدي كلون OV7A به موازات يكديگر بر روي پرده نايلوني بارگذاري گرديد. به منظور تهيه جستجوگر نشاندار، cDNA كلون OV7A توسط پرايمر اختصاصي و به كمك روش PCR تكثير يافت. پس از انجام هيبريداسيون شكافي، شدت رنگ لكه‌هاي ايجاد شده مربوط به DNA ژنومي و پلاسميدي با يكديگر مقايسه و سپس فراواني توالي‌هاي مشابه نسبت به cDNA نشاندار محاسبه گرديد. به منظور تاييد نتايج به دست آمده، تكنيك بلوتيگ سوترن با كمك هضم DNA ژنومي به وسيله تعدادي از آنزيم‌هاي اندونوكلئاز محدودالاثر صورت گرفت. در بلوتينگ سوترن، عمل هيبريداسيون با جستجوگر اوليه نشان داد كه در مواردي كه توالي اختصاصي شناسايي آنزيم‌هاي اندونوكلئاز در جستجوگر موجود نيست، عمل هيبريداسيون منجر به مشاهد يك باند مي‌گردد. اين مطالعه آشكار ساخت كه ژنوم آنكوسركا حاوي يك نسخه از cDNA نشاندار به ازاي هر هاپلوئيد ژنوم مي‌باشد.

Aspartic proteases are a relatively small group of enzymes which express in various nematodes including Onchocerca volvulus. An estimation of the gene copy number corresponding to the OV7A clone, which contains a cDNA insert encoding approximately two thirds of the entire coding sequence of aspartic protease of O. volvulus, was made by slot blot analysis in a closely related species O. gibsonigenome. Nylon membrane was loaded with serial dilutions ofgenomic DNA alongside the OV7A plasmid DNA before hybridizing the membrane to that 32 P labeled cDNA insert. To prepare the initial probe, OV7A cDNA insert was lified using gene specific primers. By comparing the signal intensity of slot blot hybridization of known amounts of genomic DNA and plasmid DNA containing the cDNA insert under similar conditions, the abundance of sequence homologues to the 32 P labeled cDNA insert in the genome was calculated. For confirmation, southern blotanalysis was performed by digesting genomic DNA with a panel of different restriction enzymes. Hybridizing patterns of the same probe revealed a single band except when predicted internal restriction sites were affected. It was confirmed that Onchocerca contains a single copy of the gene corresponding to this cDNA insert per haploid genome.