همسانه‌سازي و بيان بالاي انترفرن گاماي گاوي در ياخته‌هاي اوكاريوتي (COS 7)

انترفرن گاما يكي از سيتوكين‌هاي كليدي‌ در تعيين پاسخ ايمني وابسته به سلول‌هايT كمكي نوع يك است. در اين مطالعه از بافت طحال گاو RNA تام استخراج گرديد و به كمك روش RT PCR ژن انترفرن گاماي گاوي همسانه‌سازي شد. cDNA ژن انترفرن گاما به ناقل بياني پستانداريpcDNA3.1(+) كه تحت كنترل پيش برنده سيتومگالوويروس انساني (CMV) است، انتقال يافت. پس از تعيين توالي ژن مشخص شد كه رديف اسيد آمينه‌هاي اين پروتئين با رديف‌هاي گزارش شده در پايگاه اطلاعات ژنتيكي براي گاو (100%)، گوسفند (95%)، بز (95%)، شتر (86%)، لاما (83%)، اسب (77%)، سگ (75%)، گربه (75%)، انسان (61%)، موش (44%) و مرغ (35%) شباهت دارد. بيان ژن انترفرن گاماي گاوي نو تركيب در شرايط آزمايشگاهي با انجام آزمون اليزا تاييد گرديد. حداكثر بيان ژن در زمان‌هاي 96 و 144 ساعت بعد از ترانسفكشن در مايع رويي سلول‌هاي رده اپتليال كليه ميمون (COS 7) بود. نتايج نشان مي‌دهد كه ناقل بياني pcDNA3.1(+) و سلول‌هاي COS 7 ترانسفكت شده با روش دي اتيل آمينواتيل دكستران (DEAE) اجازه بيان ژن انترفرن گاما را داده و اين پروتئين در مايع رويي كشت سلولي به خوبي ترشح مي‌شود.

Interferon gamma (IFN γ) is one of the key cytokines in defining T helper 1 lymphocyte immune responses. In this study, the bovine IFN γ gene was cloned from spleen tissue RNA using the reverse transcription polymerase chain reaction (RT PCR). IFN γ cDNA was sub cloned and expressed in mammalian expression plasmid (pcDNA3.1(+)) under the control of the human cytomegalovirus (CMV) promoter. The predicted amino acid (aa) sequence of bovine IFN γ compared with corresponding known sequence from bovine (Bos taurus) was 100% identity and with ovine, caprine, camel, lama, equine, canine, feline, human, mice and chicken cytokine was 95, 95, 86, 83, 77, 75, 75, 61, 44 and 35%, respectively. Invitro expression of recombinant bovine IFN γ (rBoIFN γ) and secretion to culture medium was confirmed by ELISA test. Maximum expression of rBoIFN γ occurred at 96 and 144 h after transfection in COS 7 cells. These results showed that pcDNA3.1 expression vector and COS 7 cells transfected by diethylaminoethyl (DEAE) dextran allowed the high level expression of bovine IFN γ gene and the release of protein in supernatant of cell culture.