تعيين توالي ژن، كلونينگ و بيان آل- آسپاراژيناز نوتركيب از سودوموناس آيروجينوزا سويه SN4 در اشريشياكلي

مقدمه: ال آسپاراژيناز جايگاه با ارزشي از جنبه كاربردهاي پزشكي و صنايع غذايي دارد. تقاضا براي اين آنزيم دارويي هرساله چندين برابر مي شود. مواد و روش ها: در اين پژوهش، يك آسپاراژيناز از سودوموناس ايروجينوزا سويه SN4، تعيين توالي و در اشريشياكلي كلون شد. پرايمر ها بر اساس آل آسپاراژيناز از سودوموناس ايروجينوزا سويه DSM50071 طراحي شدند كه بر اساس توالي ژن 16S rRNA شباهت بالايي را نسبت به سويه SN4 نشان مي داد. ژن آسپاراژيناز در معرض هضم آنزيمي توسط آنزيم هاي برشي NdeI و XhoI قرار گرفت و سپس، به داخل پلاسميد pET21a الحاق شد. محصول الحاق به درون سلول هاي مستعد E. coli (DE3) pLysS DH5a با روش CaCl2 ترانسفورم شد. سلول هاي E. coli ترانسفورم شده در محيط LB آگار حاوي 100 ميكروگرم/ ميلي ليتر آمپيسيلين و IPTG (1mM) رشد داده شدند. نتايج: ال آسپاراژيناز نوتركيب در باكتري BL21 E. coli پس از 9 ساعت انكوباسيون، به ميزان بالايي القا شد و فعاليت آسپاراژينازي بالايي به ميزان 4/93 واحد در ميلي ليتر را نشان داد. ال آسپاراژيناز نوتركيب تعيين توالي شد و نتايج همرديفي نشان داد كه توالي پيشنهادي اسيد آمينه ايي آن از 350 اسيد آمينه تشكيل شده كه شباهت بالايي با ال آسپاراژيناز هاي ساير سودوموناس ايروجينوز ها در حدود 99 درصد را نشان مي دهد. نتايج نشان مي دهد كه آل آسپاراژيناز SN4، باقي مانده هاي كاتاليزي و نواحي حفظ شده مشابه با ساير آسپاراژينازها را داراست. بحث و نتيجه گيري: پژوهش حاضر نخستين گزارش در مورد كلونينگ و بيان آل آسپاراژيناز نوتركيب از سودوموناس آايروجينوزا در اشريشياكلي است كه منبع بالقوه ايي از ال آسپاراژيناز را براي بررسي اثر ضدسرطاني آن هم در شرايط آزمايشگاه و هم در موجود زنده فراهم مي كند.

Introduction: L asparaginase is in an excessive demand in medical applications and in food treating industries, the request for this therapeutic enzyme is growing several folds every year. Materials and methods: In this study, a L asparaginase gene from Pseudomonas aeruginosa strain SN4 was sequenced and cloned in E. coli. Primers were designed based on L asparaginase from P. aeruginosa DSM 50071, which show high similarity to SN4 strain, according to 16S rRNA sequence. The L asparaginase gene was exposed to restriction digestion with NdeI and XhoI enzymes and then ligated into pET21a plasmid. The ligated sle was transformed into competent E. coli (DE3) pLysS DH5a cells, according to CaCl2 method. The transformed E. coli cells were grown into LB agar plate containing 100 micro g/ml icillin, IPTG (1 mM). Results: Recombinant L asparaginase from E. coli BL21 induced after 9 h of incubation and showed high L asparaginase activity about 93.4 IU/ml. Recombinant L asparaginase sequencing and alignments showed that the presumed amino acid sequence composed of 350 amino acid residues showed high similarity with P. aeruginosa L asparaginases about 99%. The results also indicated that SN4 L asparaginase has the catalytic residues and conserve region similar to other L asparaginases. Discussion and conclusion: This is the first report on cloning and expression of P. aeruginosa L asparaginases in Escherichia coli. These results indicated a potent source of L asparaginase for in vitro and in vivio anticancer consideration.