همسانه سازي cDNA كد كننده انكسين آ 1 انساني در يك حامل بياني يوكاريوتي

Annexin A1 يك پروتئين قابل تحريك با گلوكوكورتيكوئيد ها است كه بواسطه ممانعت از عملكرد آنزيم فسفوليپاز سيتوپلاسمي و ممانعت از توليد آراشيدونيك اسيد و تبديل آن به ايكوزانوئيك اسيد ها عمل مي كند. بنابراين، فعاليت آنزيمي iNOS و COX2 را كاهش مي دهد. لذا احتمالا اين پروتئين در ممانعت از التهاب سلولي تاثير دارد. بنابراين به منظور مطالعات بيشتر در مورد اثرات محافظتي ANX І در اختلالات عصبي تصميم به ساخت توالي كد كننده (CDS) در يك وكتور مناسب در راستاي بررسي اثرات افزايش بيان آن در شرايط التهاب عصب در يك سلول پيش ساز عصب گرفتيم. ابتدا RNA از خون يك داوطلب سالم جداسازي شد. سپس cDNA سنتز شد و RTPCR با پرايمرهاي اختصاصي براي ANX I انساني انجام شد. در دومين مرحله قطعه تكثير شده مجددا جهت انجام PCR با استفاده از پرايمر هاي اختصاصي بكار گرفته شد و جايگاه برش AgeI و توالي FLAG بترتيب در بالا و پائين دست ANX I CDS قرار داده شد. cDNA كد كننده ANX IFlag به درون وكتور pTZ/T الحاق گرديد. پلاسميد نوتركيب حاصل براي اطمينان از صحت انجام كلون ANX I CDS تعيين توالي گرديد. در مرحله بعدي قطعه DNA كد كننده ANX IFlag در PGL268 بعنوان يك وكتور اختصاصي يوكاريوتيك الحاق شد. PGL268 يك اپي زومال وكتور داراي توالي S/MAR جهت حفظ خصوصيت خارج كروموزومي وكتور است. نتايج نشان داد كه cDNA كايمريك كد كننده ANX IFlag بطور اختصاصي در يك وكتور بياني جهت آزمايش بيشتر كاربردهاي ANX I الحاق شد.

Annexin A1 (ANX I) is an inducible protein and acts through inhibiting cPLA2a to block the release of arachidonic acid and its subsequent conversion to eicosanoids. It reduces the activity of iNOS and COX2 enzymes. Therefore, this protein may be effective in prevention of cell inflammatory conditions. Thus to elucidate the protective effects of ANX І in neuroinflammtory disorders, we decided to construct its coding sequence (CDS) in an appropriate vector to examine its overexpression effects in neuroinflammatory conditions in a neural progenitor cell. Hence, at first step, RNA was extracted form fresh blood sle taken from a healthy individual donor. cDNA was synthesized and RTPCR was performed with suitable primers for human ANX I. In the second step, The lified fragment was subsequently used again for PCR, to introduce AgeI Cleavage site and FLAG upstream and downstream of ANX I CDS, respectively. CDNA fragment encoding ANX IFlag was inserted into the pTZ (T)Vector. The recombinant plasmid was sequenced to ensure proper cloning of ANX I CDS. Finally, DNA fragment encoding ANX IFlag was inserted into the PGL268, an appropriate eukaryotic expression vector, which is an episomal vector containing S/MAR sequences to retain this vector at episomal state. Chimeric cDNA encoding ANX IFlag was appropriately inserted in an expression vector to examine its further applications in neural precursor cells. Due to the presence of S/MAR sequences in the plasmid, the overexpression of ANX I would be in episomal state.