Isolation of lytic bacteriophages against pathogenic Escherichia coli strains in poultry in the northwest of Iran

در این مطالعه 90 نمونه از اندام­های داخلی طیور دارای علایم بالینی کلی باسیلوز از مرغداری­های اطراف مراغه در استان آذربایجان شرقی به دست آمد. 70 جدایه باکتریایی از نمونه­‌های اخذ شده با استفاده از تست­های بیوشیمیایی استاندارد به عنوان اشریشیا کلی مورد تایید قرار گرفتند و حساسیت آنتی بیوتیکی این جدایه‌­ها با روش انتشار از دیسک تعیین گردید. آنتی بیوتیک‌­های مورد استفاده در این مطالعه شامل آمپی‌سیلین، پنی‌سیلین، نیتروفورانتوئین، تتراسایکلین، آموکسی سیلین، سیپروفلوکساسین، نالیدیکسیک اسید و سولفامتوکسازول بود. از بین آنتی بیوتیک­‌های مورد استفاده، جدایه‌­ها بیشترین حساسیت را نسبت به  سیپروفلوکساسین نشان دادند درحالی که کمترین حساسیت به پنی‌سیلین و آموکسی سیلین مشاهده گردید. 50 % از جدایه‌ها حداقل نسبت به پنج آنتی بیوتیک مقاوم بودند و 10 جدایه دارای مقاومت آنتی بیوتیکی چندگانه به منظور جداسازی باکتریوفاژ با روش نقطه‌ای و آگار دو لایه انتخاب شدند. نمونه‌های آبی برای جداسازی باکتریوفاژها از رودخانه‌ها، فاضلاب مرغداری‌ها و مرکز تصفیه فاضلاب مراغه تهیه گردیدند. از 10 فاژ جداسازی شده در این مطالعه، هشت فاژ از مرکز تصفیه فاضلاب جدا شد. بعد از غنی‌سازی، خالص‌سازی و تعیین عیار محلولهای فاژی، تغلیظ آنها با استفاده از روش رسوب با پلی اتیلن گلیکول صورت گرفت. کمترین و بیشترین عیار فاژی حاصل به ترتیب 05/1*106 و 9/1*109 ارزیابی شد. طیف میزبانی فاژهای جداشده علیه جدایه­‌های اشریشیا کلی با روش نقطه‌­ای بررسی شد و یکی از محلول‌های فاژی علیه چهار جدایه از ده جدایه اشریشیا کلی اثرات ضدباکتریایی نشان داد که به عنوان فاژ دارای پتانسیل بالا جهت فاژدرمانی معرفی گردید. در تجزیه و تحلیل مورفولوژیک فاژ منتخب با استفاده از میکروسکوپ الکترونی گذاره یک فاژ با سر چند وجهی به قطر 95 نانومتر و دارای دم قابل انقباض به طول 90 نانومتر مشخص گردید که نشانگر تعلق این فاژ به خانواده میوویریده بود. بر اساس نتایج حاصل از مطالعه حاضر، باکتریوفاژها می‌توانند به عنوان جایگزین مناسبی برای مبارزه با سویه های اشریشیا کلی بیماری‌زای مقاوم به آنتی بیوتیک طیور باشند. با توجه به اثربخشی متغیر فاژها علیه جدایه‌­های مختلف اشریشیا کلی بیماریزای خارج روده‌ای طیور، انجام مطالعات بیشتری در زمینه کارایی فاژهای لیتیک علیه سویه‌های باکتریایی مختلف جهت کنترل موثر عفونتهای خاصی در این منطقه از ایران توصیه می گردد.

In this study, 90 internal organ samples of poultry with symptoms of colibacillosis were obtained from Maragheh poultry farms in East Azerbaijan, Iran. In total, 70 bacterial isolates were confirmed as Escherichia coli (E. coli) strains using standard biochemical tests, and antibiotic sensitivity was determined by the disk diffusion method. Antibiotics used in this study included ampicillin, penicillin, nitrofurantoin, tetracycline, amoxicillin, ciprofloxacin, nalidixic acid, and sulfamethoxazole (n=8). Ciprofloxacin showed the highest susceptibility, while the lowest susceptibility was observed with penicillin and amoxicillin. Among the bacterial isolates, 50% showed resistance to at least five antibiotics, and 10 isolates with multidrug resistance were selected for bacteriophage (phage) isolation against recent E. coli isolates using spot test and double-layer agar overlay technique. In addition, water samples for phage isolation were provided from rivers, poultry farm sewages, and an urban sewage treatment center. In total, eight phages were successfully isolated from the urban sewage treatment center (total: 10). After enrichment, purification and titration, phages were further concentrated by polyethylene glycol precipitation. Lowest and highest bacteriophage titers were determined to be 1.05×106 and 1.9×109 PFU/ml, respectively. Host range of the isolated phages was assayed by spot testing, and antibacterial effects against four E. coli isolates were observed in one of the isolated phage suspensions, which was introduced as the most potentiated agent for phage therapy. In the morphological analysis of the selected phage using an electron microscope, we observed a hexagonal head with a diameter of 95 nm and contractile tail length of 90 nm, which indicated its similarity to the Myoviridae family. In conclusion, results of this study showed that bacteriophages could be appropriate alternatives to combat pathogenic E. coli strains with antibiotic resistance in poultry. Considering the changeable antibacterial effects of bacteriophages against different isolates of extraintestinal avian pathogenic E. coli, it is suggested that future investigations be conducted regarding the efficacy of lytic phages against different bacterial strains for the effective control of the associated infections in this region of Iran.