Comparison of bacterial biomass and PRP production between different isolates of Haemophilus influenza type b (Hib) under different culture conditions

همافيلوس آنفولانزاي تيپ b باكتري است گرم منفي, پليو مورفيك و مهمترين عامل مننژيت در كودكان زير 5 سال به خصوص تا2 سال مي باشد. در اين مطالعه جدايه هاي مختلف Hib كه از بچه هاي مشكوك به مننژيت جدا شده بودند با استفاده از روشهاي مختلف ميكروبي , بيوشيميايي و سرولوژيكي تشخيص و مورد شناسايي قرار گرفتند . در اين تحقيق محيط هاي مختلف كشت از جمله محيط مايع بهبود پيدا كرده و تهيه شده(GC medium Base GCB) در آزمايشگاه موسسه رازي ومحيط هاي تجاري( Brain Heart Infusion BHI) و ( TSB ) Trypticase Soy Broth براي مقايسه و انتخاب بهترين ميزان رشد (bacterial biomass ) جدايه هامورد استفاده قرار گرفتند . به تمام محيط هاي مذكور 2 فاكتور مهم mg/lit 10 X (hemin) و ساپليمنت IsovitalX حاوي فاكتور V به ميزان /ml 01/0 كه لازم براي رشد اين ميكرو ارگانيزم مي باشد اضافه گرديد . ميزان رشد با شروع cfu 104 باكتري در هر ليتراز محيط كشت آغاز گرديد. نتايج بدست آمده مقدار حجم رشدي بسيار نزديكي را در محيط ها نشان داد اگرچه محيط GCB ( modified گرديده) ميزان رشد بيشتري را نسبت به ساير محيط هاي تجاري داشت و اين محيط براي رشد , استخراج و تخليص PRP(CPS) استفاده گرديد. در اين مطالعه توليد PRP بر اساس تكنيك ها و امكانات موجود در بخش از جمله فنل كلروفرم بجاي Ultrafiltration براي به حداقل رساندن موادي مانند اندوتاكسين ومواد پروتييني استفاده گرديد. همچنين كاهش بعضي از پروسه هاي شيميايي و اضافه نمودن روش هايي از جمله استفاده از آنزيم هايي مانند Pronease و Phospholipase براي از بين بردن پروتيين باقيمانده و مواد فسفاتي در تخليص PRP صورت گرفته و مقدار PRP حاصله با استفاده از روش بيال تعيين گرديد. نتايج اين مطالعات نشان داد اگر چه تفاوت چنداني در مقدار PRP بدست آمده در بين سه تا از سويه ها با مقدار متوسط mg/lit 108 مشاهده نگرديد , اما سويه ATF2 مقدار PRP بسياربالايي را ( mg/lit 192 ) نشان داد و همچنين پايين ترين مقدار PRP مربوط به سويه ( H.inf1 (16mg/lit بود . به نظر مي رسد كه داده هاي بدست آمده از آزمايش مي توانند متعلق به يك جامعه نرمال با ميانگين 4/106 و انحراف استاندارد 5/62 باشد . بنا به نتيجه ي آزمون يك نمونه اي كولموگروف اسميرنوف فرضيه فوق تاييد شد (P=0.5) . حال با مشاهده mg/lit 192? PRP مقدار توليد PRP توليد شده قابل توجه مي باشد . مقدار پروتيين و نوكلييك اسيد موجود در PRP در طول موج هاي 280 و 260 نانومتر به ترتيب 10% و 5% تخمين زده شد.

Heamophilus influenzae type-b (Hib) is a gram - negative pleomorphic bacterium that causes meningitis infections in children with the age of less than 5 years particularly in two years old infants. In the present study various isolates of Heamophilus influenzae from infants suspected to meningitis were collected, identified, characterized and were used throughout our experiments. Different culture media namely Brain Heart Infusion Broth (BHIB), Tryptic Soy Broth (TSB) and GC medium Base (GCB) which this medium was modified and prepared in our own laboratory, were compared to determine the highest bacterial yield. All media were added supplements 10mg/ml hemin & 0.01/ml IsovitaleX containing V factor. The bacterial yield for all Hib strains present in our laboratory were measured with an initial inoculums of 104 cfu per ml. The result showed very closed amount of biomass for all isolates however, GCB had slightly higher yield and ultimately we chose this medium for cultivation and extraction of capsular polysaccharide (CPS-b). In our laboratory we have adapted the PRP production according to our technical and instrumental availabilities which exists in our laboratories replacing ultra centrifugation to phenol chloroform to remove contaminants like endotoxin and proteins to the minimum level and also decreased the number of some chemical treatments while some steps were added in purification process. Our study showed although there were not significant differences between the PRP extract of the three isolates with average amount of 108 mg/lit, however, isolate ATCC10210 (ATF2) showed the highest amount with 192mg/lit and the least PRP was produced by isolate H.inf.1, with 16 mg/lit. It seems that the data can be categorized to a normal distribution with the mean of 106.4 and standard deviation of 6.25. This result was confirmed by one sample kolmogorov-Smirnov test, hence the PRP ?192 mg/lit is statistically significant at a significant level of ? =0.10 (P=0.085). The amount of contaminants e.g protein along with nucleic acid present in PRP was estimated at optical density 280 and 260nm, were under 10% and 5% respectively.