Detection of single Dactylogyrus spp. in DNA Extracted From Infected Gill Tissue of Fishes Using Polymerase Chain Reaction

داكتيلوژيروس ها يك مونوژن است كه به عنوان انگل خارجي آبشش، چندين گونه از ماهيان مانند كپور وحوض را آلوده مي كنند. معمولي ترين روش شناسايي اين انگل ها، بررسي ميكروسكوپي لاملاهاي آبشش است كه روشي وقت گير و دشوار مي باشد. در مقابل به كارگيري تكنيك هاي مولكولي روشي اختصاصي وحساس تر جهت تشخيص انگل ها محسوب مي شوند. در اين مطالعه، روش PCR و تعيين توالي براي تشخيص گونه هاي داكتيلوژيروس استفاده گرديد. بدين منظور پرايمرهايي از ناحيه ITS-1 ژن RNAريبوزومي انگل براي تكثير DNAگونه هاي مختلف انگل هاي داكتيلوژيروس طراحي گرديد. سپس69 عدد انگل داكتيلوژيروس از 100 ماهي حوض به روشهاي ميكروسكوپي جدا گرديد و به دنبال تعيين گونه انگل با روش ميكروسكوپي، استخراج DNA از هر يك از انگل ها انجام شد. به منظور ارزيابي توانايي PCR طراحي شده براي تشخيص انگل در بافت آبشش، استخراج DNA از انگل ها به همراه بافت آبشش نيز انجام گرديد. به علاوه PCR بافت آبشش عاري از انگل، به عنوان كنترل منفي انجام گرديد. در مرحله بعد محصولPCR تخليص و تعيين توالي گرديد. اندازه محصول PCR براي گونه هاي مختلف داكتيلوژيروس 532 جفت باز بود. بدنبال تكثير DNA تخليص شده از بافت آبشش حاوي انگل داكتيلوژيروس نيز محصول PCR با اندازه 532 جفت باز مشاهده گرديد اما هيچ گونه محصولي به دنبال PCR بافت آبشش عاري از انگل مشاهده نگرديد. بدنبال مقايسه توالي نوكليوتيدهاي محصولاتPCR با توالي نوكليوتيدهاي موجود در GenBank، 100 درصد تشابه با دو گونه داكتيلوژيروس واستاتور و داكتيلوژيروس دولكايتي مشاهده گرديد. نتايج بدست آمده از روش ملكولي كاملاً مشابه نتايج حاصل از بررسي هاي ميكروسكوپي بود. بنابراين، نتايج حاصل نشان مي دهد كه امكان استفاده از روش هاي مبتني بر PCR، براي شناسايي ماهيان آلوده به داكتيلوژيروس از طريق استخراج DNA به طور مستقيم از كل بافت آبشش آلوده به داكتيلوژيروس وجود دارد.

Dactylogyrus spp. are monogenean worms found mostly as ectoparasites on the gills of several fish species, including carp and goldfish. These parasites are commonly detected by microscopic analysis of the gill lamellae, but this is time-consuming and technically difficult. In contrast to this conventional method, molecular techniques provide specific, sensitive and safe detection of parasites. In the present study, polymerase chain reaction (PCR) and subsequent DNA sequencing were used to detect Dactylogyrus spp. Specific common primers were designed to amplify the ITS-1 region of the rRNA gene of Dactylogyrus spp. Dactylogyrus worms were collected from 100 goldfishes and identified using a dissection microscope. Then, single worms were used for DNA extraction. To evaluate the PCR, a single parasite was added to a parasite-free gill, which then had its DNA extracted. Subsequently, the PCR products were purified and sequenced. Comparison of the nucleotide sequences of the PCR products with GenBank sequences showed that there was 100% homology with sequences from two Dactylogyrus spp., namely Dactylogyrus vastator and Dactylogyrus dulkeiti (registered under accession numbers AJ 564159 and AJ 564126, respectively). The results obtained from sequence analyses were consistent with species identification by microscopy. Therefore, the results show that it is possible to develop a sensitive and precise PCR method for the detection of Dactylogyrus-infected fish using DNA extracted from the whole gill.