Isolation, purification and characterization of proline dehydrogenase from a Pseudomonas putida POS-F84 isolate

هدف از اين مطالعه، جداسازي و تعيين مشخصات آنزيم پرولين دهيدروژناز از ميكروارگانيسم هاي خاك ايران بود. جداسازي و غربالگري آنزيم هاي تخريب كننده L-پرولين از نمونه هاي خاك انجام شد. جدايه توسط شاخصهاي بيوشيميايي و آناليز ژن RNA ريبوزومي s16 تعيين مشخصات گرديد. پرولين دهيدروژناز هدف تخليص شد و اثرات pH و دما بر فعاليت و پايداري آزمايش شدند. از ميان 150 جدايه هاي بدست آمده از 30 نمونه خاك، تنها يك جدايه كه به عنوان سودوموناس پوتيدا شناسايي شد بالاترين فعاليت آنزيمي را نسبت به L-پرولين (U/ml2200) نشان داد. آنزيم مورد نظر به عنوان پرولين دهيدروژناز مشخص گرديد و داراي ثابت ميكاييليس-منتن 35 ميلي مولار براي L-پرولين بود. وزن مولكولي پرولين دهيدروژناز خالص سازي شده در حدود 40 كيلو دالتون بود و به عنوان يك پروتيين منومري شناسايي شد. تواليهاي آمينواسيدي –Nترمينال زير واحد آنزيم سودوموناس پوتيدا، MLTSSLTRIIGKSGE بود. پرولين دهيدروژناز فعاليت بالايي در محدوده دمايي 25 تا 35 درجه سانتي گراد نشان داد و بالاترين فعاليت در 30 درجه سانتي گراد بدست آمد. آنزيم در دماهاي بين 25 تا 30 درجه سانتي گراد تقريبا به مدت 2 ساعت پايدار بود. pH فعاليت بهينه پرولين دهيدروژناز در 5/8=pH بود و در محدوده 9-8=pH به مدت 24 ساعت پايدار بود. آنزيم با بازده 5/8 درصد و فاكتور تخليص 7/37 خالص سازي شد. اين تحقيق اولين گزارش از توليد پرولين دهيدروژناز توسط سودوموناس پوتيدا جداسازي شده از نمونه خاك مي باشد

The purpose of this study was to isolate and characterize Proline Dehydrogenase (ProDH) enzyme from microorganisms isolated from soil in Iran. Isolation and screening of L-proline degradative enzymes from soil samples was carried out. The isolate was characterized by biochemical markers and 16S rRNA gene analysis. The target ProDH was purified and the effects of pH and temperature on the activity and stability were tested. Among the 150 isolates recovered from 30 soil samples, only one was identified as Pseudomonas putida displayed the highest enzyme activity toward L-proline (2200U/l). The enzyme was identified as a ProDH and had Km value of 35 mM for L-proline. The molecular mass of the purified ProDH was about 40 kDa, and determined to be a monomeric protein. The N-terminal amino acid sequences of the subunit of P. putida enzyme were determined to be MLTSSLTRIIGKSGE. ProDH exhibited high activity at temperature range of 25 to 35?C and the highest activity was achieved at 30?C. It was almost stable at temperatures between 25-30?C for 2 h. The optimum pH of ProDH activity was determined in pH=8.5 and it was stable in pH range of 8.0-9.0 up to 24 h. The enzyme was purified with a yield of 8.5% and a purification factor of 37.7. Briefly, a ProDH flavonzyme was purified and characterized from a P. putida bacterium. The specificity of P. putida enzyme toward L-proline is advantageous for the application to the L-proline analysis