شناسه هاي افزوده :
بهمني، محمود ، همكارطرح , برادران نويري، شهروز ، همكارطرح , نوروزفشخامي، محمدرضا ، همكارطرح , كاظمي، رضوان اله ، همكارطرح , چكمه دوز، فريدون ، همكارطرح , يارمحمدي، مهتاب ، همكارطرح , محمدي پرشكوهي ، حسين ، همكارطرح , دپوردهقاني، محمد ، همكارطرح , يگانه، هوشنگ ، همكارطرح , برادران طهوري، هادي ، همكارطرح , ناظمي، مليكا ، همكارطرح
چكيده فارسي :
در اين تحقيق، امكان توليد تاسماهي شيپ ماده ژاينوژنتيك تغيير جنسيت يافته به نر بررسي شد. براي اين منظور از مولد ماده شيپ و تاسماهي سيبري نر پرورشي موجود در انستيتو تحقيقات بين المللي ماهيان خاوياري دكتر دادمان استفاده شد. استحصال اسپرم و تخمك بر اساس روشهاي مرسوم صورت گرفت. جهت تخريب DNA اسپرم با حفظ اثر تحريك تخمك، از اشعه UV (UVG-54) استفاده شد. بدين منظور جداسازي مايع سمينال از اسپرم بمدت 5 دقيقه با سرعت 5000 دور در دقيقه سانتريفيوژ انجام و سپس در دماي 4 درجه سانتيگراد نگهداري گرديد. مدت زمان تحرك اسپرم بررسي شد. ابتدا اسپرم 10% تهيه
(1 ميلي ليتر اسپرم به 9 ميلي ليتر مايع سمينال) و با دوز ثابت 473µw/cm2 در فاصله 12 سانتي متري تحت تاثير اشعه UV در فواصل زماني 0، 60، 90، 120، 180 و 210 ثانيه قرار گرفت. همچنين جهت تكميل آزمايشات اشعه، اسپرمهاي UV داده شده و شاهد با تخمك تاسماهي شيپ لقاح داده شده و نتايج آن بررسي گرديد. بمنظور ديپلوئيد سازي و القاي ژاينوژنزيز ميوزي از شوك سرمايي 5/2 درجه سانتيگراد به مدت 30 دقيقه، 10 دقيقه بعد از تركيب تخمك و اسپرم استفاده شد. 5 تيمار: ژاينوژن (اسپرم اشعه داده تاسماهي سيبري + تخمك ماهي شيپ + شوك سرمايي)، هاپلوئيد (اسپرم اشعه داده تاسماهي سيبري + تخمك ماهي شيپ بدون شوك سرمايي)، تريپلوئيدي (اسپرم تاسماهي سيبري + تخمك ماهي شيپ + شوك سرمايي)، دورگه (اسپرم تاسماهي سيبري+ تخمك ماهي شيپ بدون شوك سرمايي) و تيمار شاهد (اسپرم ماهي شيپ + تخمك ماهي شيپ بدون شوك سرمايي) در نظر گرفته شد.
جهت اثبات ژاينوژنزيز، از روش فنوتيپيك و ارزيابي ژنتيكي ميكروستلايت با استفاده از پرايمرهاي تاسماهي درياچه اي بر روي لارو و بچه ماهيان انگشت قد توليدي استفاده گرديد.
جهت تغيير جنسيت بچه ماهيان ژاينوژن جداسازي شده در سن 5 ماهگي و قبل از تمايز آناتوميك گنادي با استفاده از هورمون 17α- متيل تستوسترون (MT) شروع شد و تا 7 ماه ادامه يافت. براي اين منظور سه تيمار: ژاينوژن شاهد (بدون هورمون)، تيمار 10 ميليگرم MT بر كيلوگرم غذا و تيمار 50 ميليگرم MT بر كيلوگرم غذا در نظر گرفته شد. بعد از هورمون تراپي با استفاده از لاپاراسكوپي و بيوپسي در سن 30-36 ماهگي نمونه برداري شد و جنسيت آنها به روش بافت شناسي گناد مورد بررسي قرار گرفت.
بررسي آماري و تجزيه و تحليل دادهها با استفاده از نرمافزار SPSS12 و Excel انجام شد. براي تعيين معنيدار بودن اختلاف بين پارامترها و مقايسه بين شاهد با تيمارها و همچنين بين تيمارهاي مختلف از تجزيه واريانس يكطرفه (ANOVA) استفاده شد. از آزمون چند دامنهاي توكي درصورتيكه اختلاف بين دادهها مشاهده ميشد براي معنيدار بودن يا نبودن اختلاف در سطح 95% استفاده گرديد.
طبق نتايج بدست آمده بهترين مدت زمان اشعه دهي با لامپ UV براي اسپرم تاسماهي سيبري 60 ثانيه با شدت 473µw/cm2 بود كه بالاترين درصد تحرك (58%) و لقاح (3/68%) را بعد از شاهد به خود اختصاص داد. ميانگين درصد لقاح در تيمار ژاينوژن 66/86 درصد، در تيمار تريپلوئيد 86/91 درصد، در تيمار هاپلوئيد 66/68 و هيبريد 100 درصد ارزيابي گرديد. ميزان درصد لقاح در تيمار شاهد 3/96 درصد برآورد شد. ميانگين درصد تفريخ تخم در گروه شاهد 4/92 درصد بود كه اين ميزان در تيمار ژاينوژن 6/60 درصد تخمين زده شد. تفاوت معني داري در درصد تفريخ تخم تيمار شاهد و تيمار ژاينوژن وجود داشت (P<0.05). ميانگين درصد تفريخ تخم در تيمار تريپلوئيد 4/99 درصد بود كه با تيمار شاهد اختلاف معني داري داشت (P<0.05). ميانگين درصد تفريخ تخم در تيمارهاي هاپلوئيد و هيبريد بترتيب 1/2 و 5/52 درصد بود كه با گروه شاهد و با همديگر داراي اختلاف معني داري بودند (P<0.05). تعداد لارو باقيمانده در تيمار هاپلوئيد داراي سندروم هاپلوئيد بودند و بصورت ناقص الخلقه تفريخ شدند كه در فاصله كوتاهي بعد از تفريخ تلف شدند.
در ارزيابي فنوتيپي ماهيان ژاينوژن و مقايسه آن با ماهيان دورگه (تاسماهي شيپ ♀ و تاسماهي سيبري ♂) مشخص گرديد كه تمامي دورگه ها غالبيت فنوتيپ خود را از مولد پدري يا تاسماهي سيبري به ارث
برده اند ولي در تيمار ژاينوژن ديپلوئيد تمامي نمونه ها شبيه گونه مادري يا ماهي شيپ بودند.
3 ماركر (Afug9, Afug63, Afu68) از 5 ماركر ميكروستلايت نشان داد كه نتاج ژاينوژن داراي الگوي ژنومي مشابه با مولد مادري (تاسماهي شيپ) خود هستند و هيچگونه وراثت پذيري پدري در فرزندان ژاينوژن مشاهده نگرديد.
در بررسي بافت شناسي از گناد ماهيان ژاينوژن شاهد مشخص گرديد كه 3/73% آنها ماده و 6/26% نر
مي باشند. بنابراين ثابت گرديد كه سيستم تعيين جنسيت در ماهي شيپ هتروگامتي ماده (ZW) بوده و جنسيت ماده نقش تعيين كننده جنسيت فرزندان خود را دارد.
در گروه تيماري با دوز 10 ميلي گرم MT / كيلوگرم غذا، 50 % از گناد ماهيان از لحاظ فنوتيپي ظاهر بيضه را نشان مي داد ولي ساختار گنادي ماده داشتند. همچنين 5 ماهي نر و 4 ماهي ماده و 9 ماهي با جنسيت بينابيني نيز در اين گروه مشاهده شد. در گروه تيماري با دوز 50 ميلي گرم MT / كيلوگرم غذا، تمامي ماهيان (100%) اين گروه در مرحله 3 رسيدگي جنسي قرار داشته و جنسيت آنها با موفقيت به نر تغيير يافته بود ولي تا آن زمان فاقد اسپرم بودند.
با توجه به اهميت اين تحقيق در توليد تاسماهي شيپ Neomale و امكان توليد نتاج تمام ماده با بازماندگي بالا در نسل بعدي و پاسخ به نياز روزافزون پرورش دهندگان ماهيان خاوياري جهت دسترسي به بچه ماهيان خاوياري تمام ماده، حفظ ماهيان ژاينوژن تغيير جنسيت يافته به نر باقيمانده توصيه مي شود. همچنين با تشخيص مكانيزم سيستم تعيين جنسيت در اين ماهي مي توان با دستكاريهاي ژنتيكي ذخاير شديدا در معرض خطر انقراض آن را احيا نمود و گامي موثر در ايجاد هر دو جنس نر و ماده با اسپرم هترولوگ برداشت
چكيده انگليسي :
Abstract:
The objective of the present study was the possible of production of ship sturgeon (Acipenser nudiventris) neomale using gynogenesis and sex reversal. For this purpose, reared ship sturgeon female and heterologous sperm of Siberian sturgeon (Acipenser baerii) male from International Sturgeon Research Institute were used.
Ovulated eggs and sperms were collected based on common procedures in hatcheries. In order to separate the seminal fluids and dilute the milts, sperms were centrifuged at 5000 rpm for 5 min, and seminal fluids stored in 4oC for further use. Sperm motility was investigated. In order to determine the best duration for irradiation, the milt was diluted (1:9) with immobilizing solution. Samples of diluted milt were placed for UV irradiation (UV lamp model UVG-54, 254 nm, made by UVP America) with constant dose 473 µw/cm2 and height of 12 cm for 0, 60, 90, 120, 180, and 210 sec. The motility of irradiated sperms and controls were examined under the light microscope and the motility curve was drawn. Also for completion of irradiation experiments, UV irradiated heterologous sperm and control sperm inseminated with normal ship sturgeon eggs. For diploidization and induction of gynogenesis, the cold shock (2.5oC) for 30 min was used 10 min after activation/fertilization. Treatments included: gynogen, haploid, hybrid triploid, hybrid diploid and control. Verification of gynogen progeny performed using phenotypic identity and microsatellite DNA markers. Gynogen progeny sex reversed at 5 months-age using 17α-methyle testosterone (MT) for 7 months duration. The treatments involved: Control gynogen (without MT), 10 mg/kg diet, and 50 mg/kg diet. Verification of sexuality carried out at 30-36 months-age using biopsy and laparaskopy. The results were analyzed using SPSS, Excell software. To determine the significant levels between various parameters and comparison between controls and various treatments, one way of Analysis of Variance (ANOVA) was used.
Results of present study showed that the best duration for UV irradiation on sperm of Siberian sturgeon was 60 seconds with constant dose 473 µw/cm2. Motility percent and fertilization rate were 58% and 68/3%, respectively. The average of fertilization rate in gynogen, triploid, haploid, hybrid and control treatments was 86.6, 91.86, 68.66, 100 and 96.3 percent, respectively. The average of hatching rate in control, gynogen, triploid, haploid and hybrid treatments was 92.4, 60.6, 89.4, 2.1 and 52.5, respectively. There are the significant differences between gynogen and control groups (p<0.05). In haploid treatments, everybody had anomalies, as haploid syndrome that died as soon.
On the basis of morphological observations, this study showed that all of the hybrids (♀Ship sturgeon × ♂Siberian sturgeon) have inherited dominant phenotype from paternal breeder. All of the randomly selected putative diploid gynogens had the same maternal morphology or Ship sturgeon. The results of microsatellite DNA analysis showed that in 3 markers (Afug9, Afug63, Afu68) of 5 markers there was no genetic contribution from the paternal genome in the gynogenetic group.
In group 10 mg/kg MT, 27.8 and 22.2 percent individuals were found males and females, respectively. Also, 50% individuals had intersex. In group 50 mg/kg MT, 100% individuals were males that placed in 3 stage of sexual maturation, and they sex reversed thoroughly.
Obtained results from sex determination in gynogen progenies have shown that 73.3% of gynogen progenies were female, and 26.6% individuals from gynogen group were male entirely. Therefore, the sex determination system is female heterogamety in ship sturgeon.
In order to production of neomale ship sturgeon and possible of production of all-female progenies with high survival in future and support of sturgeon aquaculturist, it suggests that was saved gynogenetic sex reversed progenies.
Irradiated Siberian sturgeon,s sperm could be used as a heterologous sperm for gynogenesis induction in other sturgeon species. Also, inducing diploid gynogenetic of endangered sturgeon population which their males cannot be recovered could be reproduced with genetically inactivated donor sperm from other sturgeon species and this method would save them from extinction.
