1295

بررسي امكان استفاده از ماركر مولكولي بر اي تفكيك تاسماهي ايراني (Acipenser persicus) و تاسماهي روسي (A. gueldeustadtti)

پوركاظمي، محمد

عزيززاده، ليلا ، همكار طرح , يارمحمدي ،مهتاب ، همكار طرح , حسن زاده صابر، محمد ، همكار طرح

1394

سازمان تحقيقات، آموزش و ترويج كشاورزي - موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

تاسماهي ايراني بعنوان گونه غالب در خزر جنوبي، بيشترين سهم توليد گوشت و خاويار ايران و درآمد ارزي كشور را بخود اختصاص ميدهد ولي از لحاظ سيستماتيك و تمايز اين گونه از تاسماهي روسي بحث بر انگيز بوده و تعدادي از محققين روسي بر اين باورند كه تاسماهي ايراني يك گونه مستقل نبوده بلكه بعنوان زيرگونه تاسماهي روسي ميباشد. اين تحقيق با هدف شناسايي و معرفي نشانگر مولكولي مبتني بر DNA اختصاصي جهت تمايز دو گونه تاسماهي ايراني و تاسماهي روسي و اثبات مولكولي تمايز آنها انجام گرديد. براي اين منظور از 8 روش مولكولي شامل: ميكروستلايت،AFLP، RAPD، توالي يابي ژن سيتوكروم b ، تعيين توالي ژنهاي 16sDNA و ND5 ، ژن رشد (Growth Hormone Gene ) و در نهايت روش نوين SNP استفاده شد. بر حسب روش كار بين 5-16 نمونه بافت باله دمي از هريك از گونه هاي مورد بررسي از نقاط مختلف درياي خزر، رودخانه سفيد رود، اورال ، ولگا جمع آوري شد. پس از استخراج DNA و ارزيابي كميت و كفيت آن، با استفاده از پرايمر هاي متعدد (بر حسب نوع ژن و روش كار بين 5 الي 110 پرايمر) واكنش PCR انجام گرديد. محصول PCRبر روي ژل پلي آكريلاميد الكتروفورز گرديد و سپس با نيتران نقره رنگ آميزي شد و يا بر روي ژل آگارز 1% و رنگ آميزي ايتيديوم برومايد مشاهده شد. در روش RAPD باندهاي متمايز DNA را بر روي ژل برش داده و پس از خالص سازي در وكتور كلون و در باكتري E.coli سويه Top 10 انتقال و سپس توالي يابي شد. بعلاوه ژنهاي رشد تاسماهي ايراني و تاسماهي روسي ابتدا با استفاده از نرم افزار هاي MEGA 4 و Gene Runner، پرايمر هاي مورد نظر طراحي گرديد، پس از تكثير با PCR در وكتور PTZ57R/T كلون و در باكتري E.coli سويه Top 10 انتقال و سپس توالي يابي شد. كل محصول PCR حاصله از تكثير ساير ژنها هم براي تمامي نمونه ها توالي يابي شد و آناليز آماري، فيلوژني و درخت تكاملي آنها رسم گرديد. در روش پليمورفيسم تك نوكلئوتيدي (SNP) پس از تشكيل بانك ژنومي ، در مجموع 4/14 ميليارد عدد نوكلئوتيد توالي يابي شد و با استفاده از نرم افزار بيوانفورماتيك اختصاصي، آناليز شباهت و تمايز ژنتيكي دو گونه مورد بررسي انجام گرفت. نتايج بررسي نشان داد كه روشهاي ميكروستلايت و AFLP تنوع ژنتيكي بين و درون گونه اي بسيار بالايي را آشكار ساختند. توالي ژن سيتوكروم b زمانيكه تعداد نمونه 4 عدد براي هريك از دو گونه تاسماهي ايراني و روسي مقايسه گرديد تمايز را نشان ميداد ولي با تكرار آزمايش بر روي 15 نمونه براي هر گونه، اين روش نتوانست دو گونه را از همديگر تفكيك نمايد. توالي كامل ژنهاي 16sDNAو ND5 ميتوكندرياي نشان داد كه دو گونه تاسماهي ايراني و تاسماهي روسي در بعضي از جايگاهها نوكلئوتيدي تفاوتهايي با يكديگر دارند ولي اختلاف معني داري نبود. نتايج توالي حاصل از قطعات كلون شده بروش RAPDو همچنين طراحي پرايمر اختصاصي بر مبناي توالي هاي بدست آمد موفق به تمايز يك باند DNA گرديد كه ميتواند دو گونه را متمايز نمايد. نتايج اين تحقيق همچنين نشان داد كه ژن رشد دو گونه تاسماهي ايراني و روسي از 645 نوكلئوتيد تشكيل يافته و پروتئيني با 214 اسيد آمينه را ترجمه ميكند. نتايج آناليز توالي بيانگر آن است كه ژن كد گذاري كننده هورمون رشد در تاسماهي ايراني و روسي بالاترين شباهت را ابتدا با ژن رشد پستانداران (71%) و سپس با مار ماهي شكلان (63%) و كمترين شباهت را با ماهيان استخواني (37%) دارد. آناليز فيلوژني بيانگر آن است كه تاسماهي ايراني و روسي در مقايسه با ساير جانوران از گونه هاي بسيار قديمي بوده و اين ژن از يك ژن رشد اجدادي منشا گرفته است. در اين تحقيق بهترين نتايج از روش پلي مورفيسم تك نوكلئوتيدي (SNP) بدست آمد كه با تعيين توالي بيش از 4/14 ميليارد نوكلئوتيد از ژنوم دو گونه تاسماهي ايراني و روسي شمال و جنوب خزر، اثبات نمود كه تاسماهي ايراني يك گونه مستقل از تاسماهي روسي است. اين دستاورد ارزشمند بعنوان بزرگترين دستاورد علمي در تمايز دو گونه از تاسماهيان مهم تجاري درياي خزر در دو دهه اخير محسوب ميشود.

Abstract: The Persian sturgeon (Acipenser persicus) is more abundant sturgeon species in the South Caspian Sea and consist the highest proportion of Iranian Caviar, meat as well as bringing maximum foreign currency income, however from systematic point of view and differentiation of this species from Russian sturgeon (Acipenser gueldenstadttii) a serious challenging issues remain, where some Russian scientist are believe that the Persian sturgeon is not as an valid species and consider it as a subspecies of Russian sturgeon. This research conducted with the objective of identification and introducing a molecular marker based on specific DNA for differentiation of two species of Persian sturgeon and Russian sturgeon via a proved molecular marker method. For this purposes 8 different molecular approaches such: Microsatellite, AFLP, RAPD, sequencing of Cytb, 16sDNA, ND5, Growth Hormone gene and finally Single Nucleotide Polymorphism (SNP) were investigated. Based on applied methodology, between 5 to 16 caudal fin tissues were sampled for each species from different region of the Caspian Sea, Sefiedrud River, Ural and Volga rivers. Following DNA extraction, its quality and quantity were determined and the PCR experiment has been conducted using 5-110 primers according to various methods and type of gene. The PCR products were electrophoresed on Polyacrilamid or agarose gels and followed by silver and Ethidium Bromide staining. In RAPD method, polymorphic DNA band was cut on the gel followed by purification and then the segments were cloned in vector in Top10 strain of E.coli, and then sequenced. Meanwhile for Growth Hormone gene in Persian and Russian sturgeon the MEGA 4, Gene runner software were used to design the appropriate primers for PCR amplification. The PCR products were cloned in PTZ57R/T vector and transformed in Top10 E.coli strain and sequenced finally. For all other genes, similar methods were applied for PCR amplification and its products were sequenced and statistical analysis as well as phylogenetical tree was performed. In Single Nucleotide Polymorphism (SNP) method, after genomic library construction, in total 14.4 billion nucleotides were sequenced and similarity/ differentiation analysis of two species were investigated using specific bioinformatic software. Results indicated that Microsatellite and AFLP methods showed high level of genetic variation both within and between species. The Cytb gene, when 4 sample sequences from each species were compared two species were differentiated, however when analysis repeated over 15 samples, the sequence comparison couldn't differentiate two above mentioned species. Full sequence comparison of 16sDNA and mtDNA-ND5 gene showed variation in some nucleotide in both species of Persian and Russian sturgeon but no significant. Results of sequences obtained from cloned segment with RAPD method and also specific primer design based on produced sequences could succeed to discover a variable DNA band that able to differentiate two species from each other. Results of the present study also showed that the growth hormone gene (GH) of Persian and Russian sturgeon consists of 645 nucleotide that translate to 214 Amino Acids. The sequence comparison indicated that the gene coding growth hormone in Persian and Russian sturgeon had the highest similarity with GH of Mammals (71%), Anguilaformes (63%) and less similarity with bony fish (37%). Phylogenetic analysis indicates that Persian and Russian sturgeon in compare to other organism are ancient species and this gene is originated from a common ancestor. At present study the most appropriate results obtained from Single Nucleotide Polymorphism (SNP) method by sequencing 14.4 billion nucleotide from genome of two species of Persian and Russian sturgeon from North and the South Caspian Sea could prove that the Persian sturgeon is a valid and independent specie. This excellent results is the biggest scientific achievement for differentiation of two highly commercial important sturgeon species in the Caspian Sea in last two decades.

تاسماهي ايراني , تاسماهي روسي , درياي خزر , تمايز گونه اي , ماركر مولكولي , SNP

تهران موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

بخشي رنگي، جدول، مصور، نمودار

موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور 44921

كتابنامه: ص. 218- 232

تاس ‌ماهيان- تعيين جنسيت

42

ب728پ

597