1752

مقايسه و بررسي امكان سميت سلولي و مولكولي عصاره جلبك ‭Cochlodinum polykrikoides ‬در سلول‌هاي كبدي موش و ماهي

مطلبي، عباسعلي

پوراحمد، جلال ، همكارطرح , شهركي، جعغر ، همكارطرح , زرشناس، غلامعباس ، همكارطرح

1391

وزارت ﺟﻬﺎد ﮐﺸﺎورزي - ﺳﺎزﻣﺎن ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت، آﻣﻮزش و ﺗﺮوﯾﺞﮐﺸﺎورزي - ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر

در اين تحقيق، ما مكانيسم هاي سيتوتوكسيك عصاره آبي ‭Cochlodinium polykricoides ‬كه مسئول شكوفايي جلبكي شديد و گسترده در خليج فارس و درياي عمان طي سال هاي ‮‭2008-2009‬ بود، را در سلولهاي كبدي كبد جدا شده موش صحرايي و ماهي قزل آلا مورد بررسي و مقايسه قرار داديم. علاوه بر اين، نقش استرس اكسيداتيو و ميتوكندري در القاي آپوپتوزيس (مرگ برنامه ريزي شده سلولي) نيز مورد بررسي قرار گرفت. سلولهاي كبدي ايزوله با پرفيوژن كبد توسط كلاژناز به دست آمد. براي تعيين ميزان ‭"ROS" ‬توليدي كبدي، دي كلروفلورسين دي استات به عنوان معرف استفاده شد. جذب رنگ فلورسنت كاتيوني، رودامين ،‮‭123‬ براي تعيين پتانسيل غشاي ميتوكندري سلولهاي كبدي استفاده شد. جذب رنگ فلورسنت آكريدين اورانژ براي تعيين آسيب غشاي ليزوزومي سلولهاي كبدي استفاده شد‭. GSH ‬و ‭GSSG ‬با روشي اسپكتروفتومتريك تعيين شد. فعاليت كاسپاز3 و فنوتيپ آپوپتوز به ترتيب با استفاده از كيت سنجش فعاليت كاسپاز 3 محصول شركت سيگما و كيت تشخيص آپوپتوز محصول شركت سيگما آلدريچ بررسي شد. انكوباسيون عصاره جلبك با سلولهاي ايزوله كبد رت، باعث ليز غشا سلولها، تشكيل گونه هاي فعال اكسيژن ‭(ROS)‬، كاهش ذخاير گلوتاتيون، سقوط پتانسيل غشاي ميتوكندري، تخليه ‭ATP ‬و افزايش در نسبت ‭ATP / ADP‬، آزادي سيتوكروم ‭C ‬به سيتوزول، فعال شدن آبشار كاسپازي و ظهور فنوتيپ آپوپتوز گرديد. آنتي اكسيدان ها ( -توكوفرول سوكسينات و ‭BHT)‬، جذب كننده هاي راديكال هيدروكسيل (مانيتول و ‭DMSO)‬، مسدود كننده هاي روزنه ي نفوذپذيري ميتوكندري ‭(MPT) (‬سيكلوسپورين، كارنيتين و تري فلوپرازين)، مهاركننده هاي ‭NADPH P‬‮‭450‬ ردوكتاز ( دي فنيل يدونيوم كلريد)، مهار كننده هاي ‭CYP‬2E1 (فنيل ايميدازول و 4-متيل پيرازول) و توليد كنندگان ‭ATP (L-‬گلوتامين، فروكتوز و زايليتول) باعث مهار فعال شدن 3‭-caspase ‬و مرگ سلولي گرديدند. داده هاي ما نشان داد كه عصاره جلبك سيگنالينگ آپوپتوز را از طريق استرس اكسيداتيو و مسير ميتوكندريايي فعال مي كند. تشكيل ‭ROS ‬به طور مستقيم مي تواند در باز شدن منافذ ‭MPT ‬ميتوكندريايي و فعال شدن آبشار كاسپازي نقش داشته باشد كه منجر به اثرات سمي ‭C.polykricoides ‬بر سلولهاي كبدي ايزوله موش صحرايي و ماهي قزل آلا مي گردد. اين يافته ها منجر به درك بهتري از اثرات سمي ‭C.polykricoides ‬بر روي سلولهاي كبد پستانداران و آبزيان مي گردد. نتايج ما حساسيت بالاتر گونه ي آبزي به اثرات سمي ‭C.polykricoides (‬بيش از دويست برابر) نسبت به گونه ي پستاندار مورد آزمايش نشان داد. از طرف ديگر در سلول هاي هپاتوسيت ماهي اثرات سمي عصاره جلبك بر غشاي ليزوزومي مشاهده گرديد كه در هپاتوسيت هاي ماهي مشاهده نگرديد

‭In this research, we investigated and compared the cytotoxic mechanisms of aqueous extract of C.polykricoides responsible for a severe and widespread HAB in the Persian Gulf and Gulf of Oman (2008-2009) in both isolated rat and trout liver hepatocytes. In addition, the role of oxidative stress and mitochondria in the induction of apoptosis were also investigated. Isolated hepatocytes were obtained by collagenase perfusion of the rat liver. To determine the hepatocyte ROS generation, dichlorofluorescin diacetate was used as the reagent. The uptake of the cationic fluorescent dye, rhodamine 123, has been used for the determination of hepatocytes mitochondrial membrane potential. Redistribution of lysosomotropic probe, acridine orange from lysosomes into cytosol was used for determination of lysosomal membrane damage. GSH and GSSG were determined using spectrofluorometric method. Caspase-3 activity and apoptosis phenotype were also determined using Sigma s caspase-3 assay kit and Sigma Aldrich apoptosis detection kit, respectively. Incubation of algal extract with isolated rat hepatocytes caused hepatocyte membrane lysis, reactive oxygen species formation (ROS), glutathione depletion, collapse of mitochondrial membrane potential, ATP depletion and increase in ADP/ATP ratio, cytochrome c release in to the hepatocyte cytosol, activation of caspases cascade and appearance of apoptosis phenotype. antioxidants ( -tocopherol succinate and BHT), hydroxyl radical scavenger (mannitol and DMSO), Mitochondrial permeability transition (MPT) pore sealing agents (cyclosporine A, carnitine and trifluoperazine), NADPH P450 reductase inhibitor (Diphenyliodonium chloride), CYP2E1 inhibitors (Phenylimidazole and 4-Methylpyrazole) and ATP generators (L-glutamine, Fructose and Xylitol) inhibited the activation of caspase-3 and cell death. Our data showed, that algal extract activate apoptosis signaling via oxidative stress and mitochondrial pathway. ROS formation could directly be involved in mitochondrial MPT pore opening and activation of caspases cascade leading to toxic effect of C.polykricoides extract on both rat and trout hepatocytes. These findings contribute to a better understanding of C.polykricoides-toxic effects on mammalian and aquatic liver cells. Our findings revealed that trout hepatocytes are much more sensitive ( more than two hundred folds) to toxic effects of C.polykricoides

ايران , كوكلودينيوم , سميت سلولي , قزل آلا و موش , خليج فارس

تهران ﻣﻮﺳﺴﻪ ﺗﺤﻘﯿﻘﺎت ﻋﻠﻮم ﺷﯿﻼﺗﯽ ﮐﺸﻮر

مصور، جدول، نمودار

موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور 40839