820

بررسي امكان تهيه ماركر ژنتيكي (Luciferase gene) جهت نشان دار كردن و رديابي بچه ماهيان سفيد (frissi kutum rutiluc) يا كپور معمولي (Cyprinus carpio) بعنوان شاخص زيستي

لالويي، فرامرز

پورغلام، رضا ، همكارطرح , بنده پور، مژگان ،‌همكارطرح , تقوي، جواد ،‌همكار طرح , قانعي، محمود ، همكار طرح , نيراني ،محجوبه ، همكار طز ح , يوسفيان، مهدي ، همكار طرح

1395

سازمان تحقيقات،آموزش وترويج - كشاورزي موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

براي اجراي اين پروزه جهت دستيابي به ژن لوسيفراز از باكتري ويبريوفيشري استفاده گرديد. براي اين منظور باكتري مورد نظراز سازمان پژوهش هاي علمي و صنعتي ايران تهيه گرديد. پس ازكشت درمحيط اختصاصي، DNA ژنومي باكتري به روش فنل – كلروفرم استخراج شد. جهت تكثير ژن هاي LuxA و LuxB از پرايمرهاي اختصاصي كه جايگاه هاي هضم آنزيمي KpnI و BamHI درسمت '5 آن تعبيه شده بوده ، استفاده گرديد. محصول PCR پس ازخالص سازي درپلاسميد PT257R كلون گرديد و سپس به سلولهاي Ecoli منتقل شد. تائيد كلون هاي نوتركيب به روش PCR بارايمرهاي اختصاصي و هضم آنزيمي انجام گرفت. پس از تائيد، قطعات LuxA و LuxB بترتيب در وكتور بياني PcDNA3.1 hug و PcDNA3.1 neo كلون و جهت تائيد آن از واكنش PCR با پرايمرهاي اختصاصي و همچنين واكنش هضم آنزيمي استفاده شد. در نهايت پس از تائيد، پلاسميدهاي نوتركيب PcDNA3.1 hug و PcDNA3.1 neo با استفاده از كيت اختصاصي به سلولهاي يوكاريوتي NIH3T3 منتقل شدند. جهت بررسي توانايي نورزائي سازه هاي ژنتيكي تهيه شده، از كشت سلولهاي NIH3T3 در حضور دكانال (بعنوان سوبسترا ) و غلظت هاي مختلف آنتي بيوتيك نئومايسين وهيگرومايسين استفاده شد. نتايج نشان داد كه پس ازگذشت 2 ساعت ازاضافه شدن سوبسترا، واكنش نورزائي آغاز مي شود و بتدريج با رسيدن به زمان 6 ساعت، ميزان نورزائي افزايش قابل ملاحظه اي مي يابد. علاوه برموارد فوق جهت تائيد بيان و توليد پروتئين لوسي فراز، از روش SDS-PAGE و وسترن بلات استفاده شد كه ايجاد باند پروتئين 76كيلودالتوني، مويد صحت آزمايشات مي باشد.

In this study lusiferse gene extracted from Vibrio fischeri. V. fischeri strain was kindly provided by Iranian Research Organization for Science and Technology (IROST). Genomic DNA extraction was carried out by Phenol-chloroform. A DNA fragment encoding the luxA and LuxB was amplified by PCR using sense and antisense primers, specific restriction sites for BamH1 and Kpn1 were introduced into 5´ end of forward and reverse primer, respectively. The PCR product was purified from agarose gel and ligated into cleaved PT257R cloning vector. Following the confirmation of the cloned Luciferase transformed into E. coli. Recombinant clones were confirmed by specific PCR and restriction enzyme digestion analysis. The luxA and LuxB fragment was released subcloned in to the PcDNA3.1 hug and PcDNA3.1 neo expression vectors, respectively. recombinant plasmid was confirmed through restriction digestion using BamH1 and Kpn1 enzymes and subsequently, transformation procedure continued into NIH3T3 eukaryote cells by specific kit. Luminescence ability of recombinant clones was tested by NIH3T3 cells and dechanal (substrate) and Neomysin and hygromysin. The results showed that luminescence start after 2 hours and then increase after 6 hours. Inaddition, the protein identity was verified by western blot analysis, the protein bands 76 kD were detected. , which indicates protein expression of luxB, luxA.

لوسيفراز , فيبريوفيشري , انتقال ژن

طرح

تهران موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور

بخشي رنگي، جدول، مصور، نمودار

موسسه تحقيقات علوم شيلاتي كشور 48275

كتابنامه: ص. 49- 50

ماهي سفيد- رديابي , كپور- رديابي

3

ب233ل

639