استفاده از روش جهش زايي هدفمند به منظور تغيير كدون مربوط به پرولين 141 به تيروزين در پراكسيداز گياهي ليپيديوم درابا (LDP)

جهش زايي هدفمند بعنوان يك ابزار قدرتمند براي مطالعه ساختار مولكولي و عملكرد پروتئين ها به كار گرفته شده است. به منظور ايجاد جهش در ژن پراكسيداز گياه Lepidium draba (LDP)، از روش بسط همپوشي (SOE-PCR) استفاده شد. در اين مطالعه كدون اسيدآمينه ي پرولين (CCA) 141 در LDP نوتركيب در موتيف Pro-X-Pro با كدون تيروزين (TAC) جايگزين شد. به اين منظور به اين منظور 4 پرايمر شامل دو پرايمر پيشرو ابتدايي و معكوس انتهايي ژن و دو پرايمر پيشرو و معكوس در نواحي نزديك به كدون 141 كه به صورت همپوشان بوده و بر روي آنها كدون پرولين با كدون مربوط به تيروزين جايگزين شده بود طراحي گرديد. عمل تكثير در دو مرحله با استفاده از پرايمرهاي پيشرو و معكوس جهش انجام شد. قطعات تكثير شده بر روي ژل آگارز يك درصد تفكيك شدند. در ادامه قطعات مربوطه از روي ژل جداسازي شده و با استفاده از PCR قطعات به هم متصل و ژن جهش يافته LDPP141Y ساخته شده در وكتور بياني pET28a(+) كلون گرديد و با استفاده از روش شوك سرمايي-گرمايي به باكتري E.Coli DH5α منتقل شد. در ادامه به منظور يافتن باكتري ترانسفرم شده حاوي ژن مد نظر، باكتري ترانسفرم شده بر روي محيط كشت LB جامد (حاوي آگار) كشت داده شده و پس از تائيد كلوني حاوي ژن مد نظر به منظور تائيد جهش در جايگاه 141 ژن، پلاسميد مربوطه تخليص و با استفاده از پرايمرهاي T7 Promoter و T7 Terminator تعيين توالي شد. نتايج بدست آمده از تعيين توالي نشان دهنده صحت ايجاد جهش در اين نقطه مي باشد. در ادامه اين ژن به منظور بررسي نقش پرولين در اين جايگاه مورد آزمايش قرار مي گيرد.