تعيين ژنوتيپ هاي ويروس اسهال ويروسي گاوان در گاوهاي با عفونت پايدار به روش RT-PCR

ويروس بيماري اسهال ويروسي گاوان (BVDV) يكي از ويروس هاي خانواده FlaviviridaeجنسPestivirus است. ژنوم ويروس، از يك RNA تك رشته اي با پلاريته مثبت كه تقريبا 12/3 kb مي باشد، تشكيل شده است. بر اساس اختلافات آنتي¬ژني و ژنتيكي، ويروس BVDV به دو ژنوتيپ 1 و 2 تقسيم مي¬شود كه از يكديگر و از ساير پستي ويروس‌ها توسط آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال (MAb) ايجاد شده بر ضد پروتئين E2، يا به‌وسيله آناليز نواحي مختلف ژنوم، مجزا مي‌شوند. در مطالعه حاضر از حداقل 400 رأس گوساله و گاو متعلق به تعدادي از گاوداري‌هاي استان فارس طي دو مرحله خون‌گيري به عمل آمد. نمونه‌هاي خون به درون لوله‌هاي حاوي ماده ضد انعقاد ريخته ‌شد. نمونه‌ها به‌سرعت به آزمايشگاه ويروس‌شناسي دانشكده دامپزشكي شيراز منتقل و جهت انجام آزمايش‌هاي PCR سانتريفيوژ ‌شدند. بافي‌كوت جداسازي شده تا زمان انجام مراحل بعدي در فريزر 70- درجه سانتي‌گراد نگهداري ‌شد. در مرحله بعد از گوساله و گاوهاي تشخيص داده در مرحله اول يا گوساله‌هاي متعلق به دامداري‌هاي با سابقه آلودگي خون گيري به عمل آمد. RNA استخراج‌ شده تا زمان استفاده به فريزر 70- درجه سانتي‌گراد منتقل گرديد. جهت غربالگري اوليه و يافتن نمونه¬هاي آلوده به پستي ويروس‌ها، واكنش زنجيره¬اي پليمراز بر روي نمونه‌هاي مخلوط انجام پذيرفت. پس از شناسايي نمونه‌هاي مخلوط مثبت مجدداً آزمايش بر روي نمونه‌ها به‌صورت تكي انجام شد و نمونه‌هاي مثبت شناسايي ‌شد. سپس آزمايش PCR nested بر روي نمونه‌هاي مثبت به‌صورت تكي انجام ‌شد. جهت تشخيص نمونه‌هاي PI، هر نمونه كه در اين مرحله مثبت مي‌بود مجدداً آزمايش PCR nested بر روي بافي‌كوت جدا شده از نمونه‌هاي خون مرحله دوم انجام گرفت. نتايج حاصل از آزمايش مولكولي با استفاده از زوج پرايمرهاي 324 و 326 كه جهت تعيين پستي ويروس در نمونه‌هاي Pool انجام شد مؤيد مثبت بودن 5گروه(20تايي) از مجموع نمونه‌هاي Pool بود. با توجه به نتايج RT-PCR و تعيين توالي محصولات، 6 مورد ژنوتيپ BVDV-1 و 2 مورد ژنوتيپ BVDV-2 شناسايي شد و دو نمونه متعلق به سويه‌ي NADL بودند.