توليد چندين برابري انتي بيوتيك استرپتومايسين با وارد كردن يك پروموتور قوي قبل از كلاستر ژن مربوطه

Production manifold of antibiotic streptomycin with knock in a strong promoter at the beginning gene clusters

CRISPR –CAS تكنيكي است كه در آن يك اندونوكلئازتوسط يكgRNA به سمت ژن مورد نظر كشانده مي شود و در آن برش ايجاد مي كند. كه در نهايت مي تواند با مكانيسم هاي ترميم مستعد خطا مثل NHEJ يا همراه با يك اليگونوكلئوئيد كه القاي مكانيسم HDR است ترميم مي شوند. در اين مطالعه با استفاده از سيستم CRISPR – CAS تصميم بر اين گرفتيم كه توليد آنتي بيوتيك از باكتري S.griseus را چندين برابر كنيم به اين صورت كه با استفاده از وكتور ساخته شده توسط zhao به نام pcrispomyces – 2 نهايتأ يك پرومتور قوي چوkas0p را در ابتداي كلاستر ژني براي توليد آنتي بيوتيك استرپتومايسين كه شامل ژن هايي چون strR1وstrB1 و.... است قرار داده و توليد اين محصول را چندين برابر مي كنيم. در اين آزمايش تصميم بر اين شد كه از وكتور kas0p pcrispomyces – 2 (داراي پروموتر kas0p) استفاده شود. ابتدا با برش توسط آنزيم Bbsl قطعه 20N طراحي شده براي ژن هدف را وارد وكتور كرده و سپس توسط برش آنزيم Spe1 ابتدا قطعه ي flanking سمت3’ پروموتور kas0p و سپس با برش آنزيم HindⅢFlanking سمت 5’ پروموتر مربوطه را وارد وكتور كرده، نهايتأ با وارد شدن اين وكتور به باكتري S.griseus باعث بيان شدن سيستم CRISPR و برش قبل كلاستر ژني انتي بيوتيك مي شود. سپس با اتصال نواحي flanking باعث استفاده از مكانيسم HDR و نهايتأ Knock in كردن پروموتر kas0p و توليد چند برابري محصول مي شود. به طور خلاصه استفاده ي اين سيستم به طور چشم گيري مي تواند در جهت توليد محصولات در مقياس بالا درصنعت وپزشكي كاربرد داشته باشد.

Abstract: CRIS PR is a technique where an endonucleasea is driven to target gene by gRNA and creates an incision in it. They finally can be repaired with error-prone repair’s mechanisms such as NHEJ or along with Oligonucleotide is induction of HDR mechanism. In this study, using the CRISPR-CAS system, we decided to multiply the antibiotic production of S. griseus bacterium. Accordingly, we used a vector made by Zhao called pcrispomyces-2 kas0p to place a strong promoter at the beginning of the gene cluster for the production of the antibiotic streptomycin which contains genes such as StrR1, StrB1,…. and we multiply the production of streptomycin. In this study, we decided to use pcrispomyces-2 kas0p vector (include kas0p promoter). First, incised by Bbs1 enzyme, we placed the piece 20 nocleotide designed for target gene into vector and then by incising the Spel enzyme, we entered the flanking piece of Kas0p promoter 3´ side. Then, by incising the Hind III enzyme, the flankins of promoter 5´was entered to vector. Finally, by entering this vector to s.griseus bacterium, crispr system is expressed and cut before gene cluster becomes antibiotics. Then, by connecting flanking areas, HDR mechanism is used and finally kas0p promoter is knocked in leading into multiplication of the product. In summary, this system can be used for large-scale production in industry and medical.