كلونينگ و بيان فيوژن ژن اپسيلون و آلفا كلستريديوم پرفرينجنز تيپ D و كلستريديوم سپتيكوم در E. coli

Cloning and expression of epsilon-alpha fusion gene of Clostridium perfringens type D and Clostridium septicum in E. coli

كلستريديوم پرفرينجنز يك باكتري بيماريزا، بي هوازي و اسپورزا مي باشد كه مسئول بيماري هاي شديدي در انسان و دام مي باشد. توكسين اپسيلون توكسين اصلي كشنده اي است كه توسط كلستريديوم پرفرينجنز تيپ B و D توليد شده و مسئول بيماري كشنده انتروتوكسمي در دام است. توكسين كشنده آلفا كلستريديوم سپتيكوم باعث بيماري جدي گاز گانگرن مي شود. هدف كلونينگ و بيان فيوژن ژن اپسيلون و آلفا كلستريديوم پرفرينجنز تيپ D و كلستريديوم سپتيكوم در E. coli است. در پژوهش حاضر از يك ساختار جديد كايمريك شامل ژن توكسين اپسيلون كلستريديوم پرفرينجنز تيپ D و ژن توكسين آلفا كلستريديوم سپتيكوم كه توسط يك لينكر كوچك به هم متصل شده اند استفاده گرديد. فيوژن ژن حاصل در وكتور pJET1.2/blunt وارد و در سلول مستعد E. coli/TOP10 كلون گرديد. پلاسميد نوتركيب ازباكتريE. coli/TOP10/pJETεα استخراج و با استفاده از روش هاي مختلفي از جمله PCR-colony ، آناليز هضم آنزيمي و تعيين توالي ارزيابي شد. پس از برش آنزيمي، فيوژن ژن از پلاسميد استخراج شد و در وكتور بياني pET22b وارد و ساب كلون گرديد. سپس وكتور نوتركيبpET22bεα در E. coli/Rosetta بيان شد، بيان پروتئين با استفاده ازSDS-PAGE و وسترن بلات مورد ارزيابي قرار گرفت. با توجه به نتايج E. coli/Rosseta و وكتور pET22b براي بيان فيوژن پروتئين مذكور مناسب مي باشد و اين فيوژن پروتئين يك كانديداي بالقوه مطالعات ايمونولوژيكي و توليد واكسن نوتركيب است.

C. perfringens is an anaerobic spore-forming, pathogenic bacterium that is responsible for severe disease in human and livestoke. Epsilon toxin is major lethal toxin which is produced by C. perfringens type B and D. It is responsible for a rapidly fatal disease enterotoxemia in livestoke. C. septicum lethal alfa toxin is responsible for serious disease gas gangrene. The aim of present study was Cloning and expression of epsilon-alpha fusion gene of Clostridium perfringens type D and Clostridium septicum in E. coli. A new construction containing C. perfringens type D epsilon toxin gene and alfa toxin gene that connected by a small linker was used. Fusion gene inserted into pJET1.2/blunt and cloned into E. coli/TOP10. Recombination plasmid extracted than E. coli/TOP10/pJETɛα and evaluated by PCR-colony, enzyme restriction and sequencing. After restriction enzyme extracted fusion gene than pJETɛα vector and ligate into expressional pET22b vector and subcloned. Subsequent recombination pET22bɛα vector expressed into E. coli/Rosetta, protein expression evaluated by use of SDS-PAGE and western blot. According to the results E. coli/Rosetta and pET22b vector are suitable for expression fusion protein ɛα and this fusion protein is a potential candidate for immunological studies and recombination