شناسايي جهش وارونگي اينترون 22 نوع1 و نوع2 ژن فاكتور 8 در بيماران و ناقلين هموفيلي A شديد با استفاده از روش (IS-PCR) Inverse Shifting-PCR

Identification of intron 22 inversion type 1 and 2 of factor VIII gene in severe hemophilia A patient and carriers using Inverse shifting PCR (IS-PCR) method

موضوع : هموفيلي A يك اختلال شايع انعقاد خون ناشي از كمبود فاكتور 8 با وراثت وابسته به جنس مغلوب مي باشد كه فراواني آن حدود 1 در 5000 تا 10000 نوزاد پسر در سراسر جهان گزارش شده است. هموفيلي A توسط طيف گسترده اي از نقص هاي مولكولي در ژن فاكتور 8 ايجاد مي شود. شايع ترين جهش، وارونگي اينترون 22 است كه اين وارونگي مي تواند توسط روش ساترن بلات ، LD-PCR و IS-PCR شناسايي شود. اهداف: اين مطالعه با هدف تعيين وارونگي اينترون 22 نوع 1 و نوع 2 در بيماران هموفيلي A و هم چنين شناسايي ناقلين جهش مورد نظر با استفاده از روش IS-PCR در جمعيت استان قم صورت گرفت. روش تحقيق: در اين مطالعه توصيفي 30 بيمار مبتلا به هموفيلي A مراجعه كننده به درمانگاه طباطبايي استان قم و همچنين تعدادي از بستگان مؤنث بيماران مورد نظر مورد بررسي قرار گرفتند . استخراج DNA ژنومي از لكوسيت هاي خون محيطي به روش Salting out صورت گرفت .در روش IS-PCR ، DNA هاي استخراج شده پس از حلقوي شدن (هضم شدن توسط آنزيم محدود كننده ي BclI و سپس اتصال انتهاي قطعات حاصل توسط آنزيم ليگاز) ، به عنوان الگو براي تكثير PCR مورد استفاده قرار گرفتند و سپس محصول PCR با استفاده از الكتروفورز ژل آگارز 1/5 % مورد بررسي قرار گرفت. دستاوردهاي مقاله: طبق نتايج بدست آمده ،% 35 از بيماران هموفيلي A شديد وارونگي اينترون 22 را داشتند . %28(7/2) از بيماران داراي وارونگي نوع 1 و %72(7/5) از بيماران داراي وارونگي نوع 2 بودند. هم چنين از 9 نفر كه براي وضعيت ناقل بودن مورد آناليز قرار گرفتند ،2 مورد فاقد آلل جهش يافته ، 5 نفر ناقل وارونگي اينترون 22 نوع 2 و 2 نفر ناقل وارونگي اينترون 22 نوع 1 بودند. نتايج اين مطالعه نشان داد تكنيك IS-PCR روشي دقيق ، سريع و قابل اعتماد جهت شناسايي جهش وارونگي اينترون 22 نوع 1 و نوع2 در بيماران هموفيلي A و همچنين ناقلين مي باشد.

Subject: Hemophilia A is a common blood clotting disorders caused by deficiency of factor VIII with X-linked recessive inheritance affecting approximately 1 in 5000 -10,000 male births worldwide. Hemophilia A caused by a heterogeneous spectrum of molecular defects in factor VIII gene .The most common mutation is the intron 22 inversion which can be analyzed by several methods, such as; Southern blotting , LD PCR or IS-PCR. Aims: This study aimed to identify of intron 22 inversion type 1 and type 2 mutation in hemophilia A patient and carrier detection of these mutation in Qom province population using IS-PCR method. Methods: In this descriptive study , 30 hemophilia A patients , who were referred to Tabatabai clinic of Qom province and a numbers of female relatives of the patients were examined. DNA purification was carried out by salting out method . Inverse shifting PCR (IS-PCR) protocol , included three steps ; BclI restriction , self-ligation of restriction fragment ends yielding BclI circle and standard PCR analysis and then IS-PCR products were analyzed on 1/5% agarose Results: According to results , 35% of patient were found to have the Intron 22 inversion . Two of patients had inv22 type 1 (28%) and five of patients were positive for inv22 type 2(72%). Also carrier status analysis showed Two cases without abnormal allel , 5 cases were carrier of inv 22 type 2 and 2 cases were carrier of inv22 type 1. The results of this study showed that using Inverse shifting PCR is a precise and rapid method for assessment of rearrangements related to intron 22h in patients and carriers of hemophilia A.