ارزيابي بيوانفورماتيكي پروتئين اگزوتوكسين A سودوموناس آئروژينوزا و بيان دگرساخت آن در اشريشيا كلي

Bioinformatics’ evaluation of exotoxin A from Pseudomonas aeruginosa and its heterologous expression in Escherichia coli

اگزوتوكسينA يكي از فاكتورهاي بيماري‌زاي سودوموناس آئروژينوزا مي­باشد كه داراي فعاليت آنزيمي ADP ريبوزيل ترانسفراز بوده و با غيرفعال كردن فاكتور2 افزايش طول پروتئين در سلول‌هاي يوكاريوتي (eEF2)، سنتز پروتئين را مهار و منجر به القاي مرگ سلول هدف مي­­شود. از اين­رو اگزوتوكسينA به عنوان نامزد در درمان سرطان شناخته مي­شود. هدف از اين مطالعه، توليد دگرساخت اگزوتوكسينA با استفاده از ناقل بياني pET-28a مي­باشد. در اين پژوهش، ابتدا توالي ژن و پروتئين اگزوتوكسينA، ميزان سميت، ايمني­زايي و اپي­توپ­هاي مرتبط با سلول­هاي لنفوسيت B وT ، توسط ابزارهاي بيوانفورماتيك مطالعه شدند. در نهايت براي توليد پروتئين دگرساخت، در يك واكنش زنجيره­اي پليمراز، با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي ژن اگزوتوكسينA از باكتري سودوموناس آئروژينوزا (ATCC27853) جداسازي و در ناقل بياني pET-28a همسانه­­سازي گرديد. با كمك هضم آنزيمي و توالي يابي سازه حاصل، pHB6، حضور ژن اگزوتوكسينA به طول 1900 جفت باز به اثبات رسيد. pHB6 در سلول اشريشيا‌كلي(BL21) با استفاده از القاءگر IPTG بيان شد. پروتئين دگرساخت بوسيله ستون كروماتوگرافي ‌تمايلي‌ نيكل‌-آگارز‌ تخليص و به كمك SDS-PAGE 12%، وزن مولكولي پروتئين بدست آمد. پروتئين ايمني­زاي اگزوتوكسين A با وزن مولكولي 69 كيلودالتون، متشكل از سه دومين­ اتصال، انتقال به سلول هدف و كاتاليتيكي است كه با ميانگين كل هيدروپاتيك منفي، يك مولكول قطبي­ مي­باشد. وجود 28.21% مارپيچ آلفا در ساختار ثانويه به عبور پروتئين از عرض غشا و پايداري آن كمك مي­كند. بهينه­سازي شدت بيان اگزوتوكسينA در زمان و غلظت­هاي متفاوت القاگرIPTG نشان داد كه بيشترين بيان در غلظت 1 ميلي­مولار به مدت 4 ساعت در دماي 37 درجه سلسيوس صورت مي‌گيرد. مطالعه برروي عملكرد پروتئين دگرساخت در حال انجام است.

Exotoxin A is a key virulence factor from Pseudomonas aeruginosa. It is an ADP-ribosyl-transferase that inhibits protein synthesis by inactivating the eukaryotic elongation factor 2 (eEF2), leading to apoptosis and cell death. Therefore, exotoxin potentially is a novel treatment approach in cancer therapy. This study evaluated exotoxin A s gene and protein sequence, toxicity, immunogenicity, and epitopes related to B and T lymphocytes using bioinformatics tools. The exotoxin A gene was isolated by PCR using specific primers and inserted into the pET28a, generating pHB6. Sequencing and enzymatic digestion confirmed the 1900 bp exotoxin A gene in pHB6. Subsequently, the heterologous protein was produced in Escherichia coli (BL21DE3). The heterologous exotoxin was purified using a nickel-affinity chromatography column and surveyed on 12% SDS-PAGE. The exotoxin A is found to be a polar molecule with an overall negative hydropathicity of 69 kDa and consists of three domains: binding, translocation to the target cell, and catalytic. Its secondary structure includes 28.21% alpha-helices, contributing to membrane translocation and stability. The results for optimization for heterologous expression of exotoxin A showed the highest expression applying 1 mM IPTG for 4 hours at 37 °C. The study of the heterologous protein function is under processing.