تاثير سازگاركردن تدريجي استوباكتر سنگالنسيس (LMG 23690T) در منابع كربني مختلف بر تحمل شرايط استرس زا در طي تخمير اسيد استيك

Effect of sequential acclimation to different carbon sources on the resistant of Acetobacter senegalensis during acetous fermentation

استوباكتر سنگالنسيس عموما در توليد محصولاتي مانند اسيد استيك و سركه در دماي بالا استفاده مي شود. شرايط تخمير اسيد استيك به دليل وجود مجموعه اي از تنش ها نظير pH پايين، غلظت زياد اسيدهاي آلي، وجود اتانول و نوسان دما بسيار پيچيده و اغلب نامساعد است. اين شرايط تنش زا معمولا منجر به كاهش زنده ماني ميكروارگانيسم ها و نيز افت بازده توليد محصول مي شوند؛ به همين دليل در مطالعه حاضر تاثير سازگار كردن تدريجي باكتري استوباكتر سنگالنسيس مقاوم به شرايط استرس زا بررسي شد. براي اين منظور، ابتدا استوباكتر سنگالنسيس به صورت متوالي در حضور سه منبع كربن مختلف شامل استيك اسيد، گليسرول و اتانول و دماهاي مختلف كشت داده شد. سپس تغييرات در زنده ماني سويه مورد نظر از طريق شمارش كلني و همچنين بررسي ظرفيت تنفس سلولي با استفاده از روش فلوسايتومتري ارزيابي شد. ميزان تغييرات در بازده توليد محصول نيز از طريق اندازه گيري غلظت اسيد اسيد استيك توليد شده سنجش شد. همچنين با استفاده از روش كروماتوگرافي گازي ميزان تغييرات در محتواي اسيد چرب سلول با كتريايي اندازه گيري شد. نتايج اين مطالعه نشان داد كه استوباكتر سنگالنسيس قادر به رشد در محيط كشت حاوي استيك اسيد، گليسرول و اتانول به عنوان منبع كربن مي باشد. با اين حال تراكم سلول هاي رشد يافته در حضور گليسرول (OD600=2/8) به عنوان منبع كربن بيش از دو برابر تراكم سلول ها نسبت به محيط كشت حاوي اتانول است. بنابراين بر اساس ميزان تراكم سلول ها، گليسرول به عنوان منبع كربن مطلوب نسبت به دو منبع ديگر انتخاب شد. بررسي زندماني سلول ها با استفاده از فلوسيتومتري نشان داد كه 37 درصد از سلول هاي رشد يافته در حضور گليسرول قادر به تحمل تنش هاي توام اتانول، اسيد استيك و pH پايين هستند. علاوه بر اين، ميزان زنده ماني سلول هاي استوباكتر سنگالنسيس رشد يافته در دماي 15 درجه سلسيوس حدود 37 درصد و زنده ماني سلول هاي رشد يافته در دماي 30 درجه سلسيوس كمتر از يك درصد بود كه اين مساله نشان دهنده تاثير چشمگير دماي پايين بر سازگاري موثر سلول ها نسبت به تنش هاي توام در زمان شروع تخمير اسيد استيك است. بررسي ميزان توليد بيومس و تغييرات غلظت استيك نشان داد كه سويه سازگار شده در حضور گليسرول در دماي 15 درجه سلسيوس بيشترين ميزان بيومس و استيك اسيد را توليد مي كند. در همين راستا تغييرات قابل توجهي در نسبت اسيدهاي چرب اشباع به اسيدهاي چرب غيراشباع در باكتري سازگار شده به شرايط محيطي مانند دماي بالا و pH پايين مشاهده شد كه يك پاسخ عمومي در ميان باكتري ها براي سازگار شدن با شرايط اسيدي است. مي توان نتيجه گرفت كه با استفاده از روش سازگار كردن تدريجي تحت تنش هاي زيركشنده، مي توان ضمن بهبود پارامتري هاي تخمير، تحمل سلول هاي استوباكتر سنگالنسيس را نسبت به تنش هاي محيطي افزايش داد.

Acetobacter senegalensis is generally used in the production of acetic acid and vinegar at high temperature. Acetous fermentation is usually done at low pH and in the presence of high concentrations of organic acids and ethanol. The main idea of the current study was to evaluate the effects of sequential acclimation to different carbon sources on the ability of A. senegalensis to withstand stressors during acetous fermentation. To achieve this aim, the bacterial strain was cultivated successively in the presence of three different carbon sources including acetic acid, glycerol, and ethanol. Then, changes in the viability of the target strain were investigated through colony counting method. In addition, flow cytometry was applied to evaluate the alterations in the respiratory capacity of the acclimated bacteria. The amount of changes in product production efficiency was assessed by measuring the amount of acetic acid produced. Additionally, using gas chromatography, the amount of changes in the fatty acid content of the cell membrane was measured. Our results showed that A. senegalensis was able to grow in the presence of glycerol, acetic acid, and ethanol. However, its growth in the presence of glycerol (OD600=2.8) was twice higher than ethanol. Additionally, flow cytometry results showed that 37% of the adapted bacterial cells in the presence of the glycerol were able to tolerate harsh condition caused by the presence of ethanol, acetic acid and lower pH. Cell viability of A. senegalensis at 15 0C was 37%. However, just around 1% of cells were viable at 30 0C. These findings suggest that lower temperature plays a key role in the adaptation to extreme conditions during acetous fermentation. The highest biomass amount and acetic acid titer was produced by the strains adapted in the presence of glycerol at 15 0C. Also, significant changes in the ratio of saturated fatty acids to unsaturated fatty acids were observed in the bacterial population acclimated to extreme environmental conditions including higher temperatures and lower pH which is a general response among bacterial strains to tolerate acidic conditions. It can be cocluded that by the method of sequential acclimation under sub-lethal stresses, it is possible both to increase the tolerance of A. senegalensis cells to environmental stresses and improve the fermentation parameters.