كلونينگ مولكولي، بيان و خالص سازي ژن اندوليزين KP27 فاژ كلبسيلا در ناقل pET28a

Molecular cloning, expression, and purification of the Klebsiella phage endolysin KP27 gene in the pET28a vector

اندوليزين‌ها، آنزيم‌هاي قدرتمندي از باكتريوفاژها هستند كه ديواره‌ي سلولي باكتري‌ها را تخريب مي‌كنند و به عنوان عوامل ضدميكروبي مؤثر به دليل اختصاصيت بالاي خود شناخته مي‌شوند. آن‌ها به طور انتخابي پاتوژن‌ها را هدف قرار مي‌دهند بدون اينكه ميكروفلوراي مفيد را تحت تأثير قرار دهند و در برابر باكتري‌هاي گرم‌مثبت و گرم‌منفي مؤثر هستند. اندوليزينKP27، يك پروتئين مقاوم به حرارت از باكتريوفاژ KP27، پتانسيل بالايي در مقابله با كلبسيلا پنومونيه مقاوم به چندين دارو نشان مي‌دهد. اين مطالعه بر روي كلونينگ، بيان، و خالص‌سازي اندوليزين KP27 تمركز دارد. در اين مطالعه از ژن KP27، پرايمرهاي اختصاصي، مواد PCR (Taqپلي‌مراز،dNTPها، MgCl2، بافر) و يك وكتور پلاسميدي pET28a استفاده شد، آنزيم‌هاي محدودكننده NcoI) و (XhoI، T4 DNA ligase، و سلول‌هاي مستعد E.coli (DH5α) به كار گرفته شدند و پليت‌هاي LB آگار حاوي كانامايسين براي انتخاب كلني استفاده شدند. پرايمرهايي با مكان‌هاي مربوط به آنزيم محدودكننده طراحي شده و ژن KP27 توسط PCR تكثير شد. براي كلونينگ، پس از تأييد محصول PCR توسط ژل الكتروفورز، محصول را خالص‌سازي كرده و سپس به همراه وكتور مربوطه، توسط آنزيم محدود كننده هضم شد. در مرحله بعد، ژن با آنزيم T4 DNA ligase درون وكتور متصل شده و به سلول‌هاي E. coli DH5α منتقل شد. پس از آن، كلني‌ها با PCR غربالگري شده، سپس پلاسميد ميني‌پرپ شده و در نهايت توسط توالي‌يابي تأييد شدند. براي بيان پروتئين، ابتدا پلاسميد به سلول‌هايE.coli BL21(DE3) منتقل شد و سپس بيان پروتئين با 0.1 ميلي‌مولار IPTG در دماي 37 درجه سانتي‌گراد به مدت 8 ساعت القا شد. پس از آن، سلول‌ها برداشت، ليز، و توسط SDS-PAGE 15% آناليز شدند تا بيان آن مورد بررسي قرار بگيرد. در نهايت، ليزات روي ستون Ni²⁺-NTA بارگذاري شده و KP27 خالص‌شده با غلظت 1.5 ميلي‌گرم/ميلي‌ليتر به دست آمد. اندوليزين KP27 با موفقيت كلون، بيان، و خالص‌سازي شد و به عنوان جايگزيني مناسب براي آنتي‌بيوتيك‌هاي سنتي و مناسب براي مطالعات بيشتر معرفي شد.

Endolysins, powerful enzymes from bacteriophages, degrade bacterial cell walls and are promising antimicrobial agents due to their high specificity. They selectively target pathogens without harming beneficial microflora and are effective against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The KP27 endolysin, a heat-stable protein from bacteriophage KP27, shows potential against multidrug-resistant Klebsiella pneumoniae. This study focuses on cloning, over-expressing, and purifying KP27 endolysin. KP27 gene, specific primers, PCR reagents (Taq polymerase, dNTPs, MgCl2, buffer), and a pET28a plasmid vector were employed. Restriction enzymes (NcoI and XhoI), T4 DNA ligase, and competent E. coli cells (e.g., DH5α) are used, with LB agar plates containing kanamycin for selection. Primers with restriction sites are designed, and the KP27 gene is amplified by PCR. For cloning, once the PCR product was confirmed by gel electrophoresis, it was purified and then digested along with the vector. Next, the gene ligated into the vector with T4 DNA ligase and transformed into E. coli DH5α cells. Afterward, colonies were screened by PCR, then plasmid minipreped, and eventually verified by sequencing. For protein expression, the first plasmid is transformed into E. coli BL21(DE3) cells, and later protein expression is induced by 0.1 mM IPTG at 37°C for 8 hours. After that, cells were harvested, lysed, and analyzed by SDS-PAGE 15% to confirm overexpression. Finally, lysate was loaded on a Ni²⁺-NTA column, and purified KP27 obtained at the concentration of 1.5mg/ml. The KP27 endolysin was successfully cloned, expressed, and purified, providing a viable alternative to traditional antibiotics and suitable for further studies.