كلون سازي ، بيان وتخليص پروتئين كايمريك متشكل از نواحي آنتي ژنيك پروتئين هاي UreB,FliDوOmp18 و ارزيابي پتانسيل آن درتشخيص سرولوژيك عفونت هليكوباكتر پيلوري

Cloning, Expression and purification of chimeric proteins comprising antigenic regions of FliD, UreB and Omp18 proteins and evaluation of its applicative potential for serodiagnosis of Helicobacter pylori infection

هليكوباكتر پيلوري به عنوان عامل عفونت‌هاي مزمن گوارشي شناخته شده است. تست سرولوژيكي يك روش تشخيصي اين عفونت در دسترس مي‌باشد هدف از اين مطالعه طراحي، كلون سازي و بيان پروتئين نوتركيب حاصل از دو ژنUreB و Omp18 از سويه بومي ايراني مي‌باشد كه مي‌تواند در طراحي كيت سرولوژيكي جهت تشخيص اين عفونت به كار رود. پس از استخراج DNA از هليكوباكتر پيلوري، ژن هاي ureB وomp18 توسط پرايمرهاي طراحي شده با واكنش PCR تكثير شده و بعد از برش آنزيمي در وكتور بياني pET-22b كلون گرديد. بيان پروتئين نوتركيب حاصل با كمك IPTG القا گرديد و با روش افينيتي كروماتوگرافي تخليص شد. خاصيت آنتي ژني پروتئين نوتركيب تخليص شده با روش وسترن بلاتينگ. تاييد گرديد. در اين مطالعه، دو قطعه‌ي ژني ureB، و omp18 به ترتيب با سايزهاي 597 و 479 جفت باز توسط PCR تكثير يافته و به شكل يك قطعه‌ي هيبريد در وكتور pET-22b كلون گرديد. بيان پروتئين نوتركيب حاصل در باكتري E. coli BL21(DE3) به شكل يك قطعه‌ي حدود 60 كيلودالتوني در SDS-PAGE ظاهر گرديده و توسط ستون Ni-NTA تخليص شد. نتايج وسترن بلات آنتي‌ژن كايمريك تخليص شده با سرم بيماران مبتلا به هليكوباكتر پيلوري نشان دهنده ويژگي آنتي‌ژني پروتئين نوتركيب حاصل بود. در مطالعه‌ي حاضر براي اولين بار پروتئين نوتركيب ,UreB- Omp18 از سويه ي بومي هيلوكوباكتر پيلوري توليد گرديد كه مي‌تواند كانديداي مناسبي جهت طراحي كيت تشخيصي هليكوباكتر پيلوري در منطقه باشد.

Helicobacter pylori (H. pylori) infection is accepted as the primary cause of chronic gastritis. Among the diagnostic methods of H. pylori infection, serological tests as an antibody-based method are widely available and relatively sensitive to detect H. pylori infection. However, the low specificity limits its application. The present study was aimed for designing, cloning and expression of UreB - Omp18 protein from Iranian H. pylori strains. After extraction of genomic DNA from focal Helicobacter pylori strain, ureB and omp18 genes were amplified by primers designed for these genes by PCR reaction and cloned into pET-22b expression vector after enzymatic cleavage. The expression of the resulting recombinant protein was induced by IPTG and purified with high purity by affinity chromatography. The antigenic properties of the purified recombinant protein were confirmed by Western blotting. In this study, two UreB andOmp18 gene fragments were amplified by PCR as 597 and 479 bp fragments, respectively, and cloned as a hybrid fragment in the pET-22b vector. The expression of the recombinant protein in E. coli BL21 (DE3) appeared as a fragment of about 60 kDa on SDS-PAGE and was purified by Ni-NTA column. Western blot results of purified chimeric antigen with sera of H. pylori infected patients showed the antigenic properties of the recombinant protein. In the present study, for the first time, the recombinant UreB-Omp18 protein was produced from the native strain of Helicobacter pylori, which can be a suitable candidate for designing a Helicobacter pylori diagnostic kit in the region.