ساخت سازواره ژني براي همسانه‏سازي بتاگلوكاناز در باكتري لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس

Generation of gene constract to insertion of beta-glucanase gene in Lactobacillus acidophilus bacteria

زمينه و هدف: پلي‏ساكاريد غيرنشاسته بتاگلوكان از اجزاي ديواره سلولي آندوسپرم غلات است كه يك عامل ضد تغذيه‌اي بوده و با ايجاد شرايط چسبنده در روده، هضم و جذب ساير مواد مغذي را در پرندگان به طور منفي تحت تأثير قرار مي‏دهد و مدفوع پرندگان را بسيار مرطوب و چسبناك مي‏كند. لذا هدف اين تحقيق ساخت سازواره ژني جهت انتقال ژن كد كننده آنزيم بتاگلوكاناز در باكتري فلور روده پرنده انتخاب گرديد. مواد و روش ها: در اين تحقيق ژن كد كننده آنزيم بتاگلوكاناز (EC 3.2.1.73) با استفاده از واكنش زنجيره‏اي پليمراز از ژنوم باكتري باسيلوس سوبتليس جداسازي و تكثير گرديد و به روش همسانه سازي T/A در حامل pGEM-T Easy كلون و به درون اشيريشياكلي ترانسفورم گرديد. همچنين توالي فرادست و فرودست ژن slp از لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس نيز به صورت جداگانه در پلاسميد pGEM همسانه سازي شدند. سپس سه ژن به روش ساب كلونينگ به ترتيب فرادست-بتاگلوكاناز-فرودست در پلاسميد pET32 همسانه سازي شد. يافته ها: تائيد صحت كلون ژن‏ها با دو روش PCR و هضم آنزيمي مورد بررسي گرفت. و صحت ساب كلونينگ با روش‏هاي PCR و هضم آنزيمي با آنزيم‏هاي XhoI و XbaI مورد ارزيابي و تاييد قرار گرفت. نتيجه گيري: سازه ژني حاصل اين امكان را فراهم مي‏آورد كه در تحقيقات آينده بتوان ژن بتاگلوكاناز را درون ژنوم باكتري لاكتوباسيلوس اسيدوفيلوس به روش نوتركيبي همسان درج نمود.

Background: non-starch polysaccharide beta-glucan is one of the components of the cell wall of cereal endosperm, which is an anti-nutritional agent and by creating sticky conditions in the intestine, it negatively affects the digestion and absorption of other nutrients in birds, and feces It makes the birds very moist and sticky. Therefore, the goal of this research was to construct a gene system for the transfer of the gene encoding the beta-glucanase enzyme in the intestinal flora of birds. Materials and methods: In this research, the gene coding for beta-glucanase enzyme (EC 3.2.1.73) was isolated and amplified from the genome of Bacillus subtilis bacterium using polymerase chain reaction, and by T/A homogenization method in pGEM-T carrier. Easy was cloned and transformed into Escherichia coli. Also, the upstream and downstream sequences of the slp gene from Lactobacillus acidophilus were also cloned separately in pGEM plasmid. Then three genes were homogenized by subcloning in the order of upstream-beta-glucanase-downstream in pET32 plasmid. Results: Confirmation of the authenticity of gene clones was investigated by two methods, PCR and enzyme digestion. And the correctness of subcloning was evaluated and confirmed by PCR methods and enzyme digestion with XhoI and XbaI enzymes. Conclusion: The resulting gene structure makes it possible to insert the beta-glucanase gene into the genome of Lactobacillus acidophilus by homologous recombination in future research.