بررسي اثر خاموش كنندگي miR-148a بربيان ژن و بروز پروتـئين TIM3 در رده سلولي AM

Investigating the effect of silencing miR-148a on expression of TIM3 in AM cell line

در لوسمي ميلوييدي حاد AML كه تحت عنوان لوسمي غير لنفوييدي نيز شناخته مي شود .سلول هاي ميلوييدي نابالغ LSC در مغز استخوان و در نهايت درخون واندام ها تجمع مي يابند وبا توليد سلول هاي خوني نرمال تداخل ايجاد مي كند. تهيه پروفايل بياني تفكيكي براي LSC و HSC هاي AML منجر به كشف TIM3 به عنوان يك مولكول سطحي اختصاصي سلول هاي LSC شد. ميكروRNA يك مسير تازه كشف شده هستند كه بيان ژن ها راتنظيم مي كند ودرتوسعه بافت وتنظيم كنندگي خون بد خيم وطبيعي نقش دارد . ميكروRNA از 22 نوكليوتيد تشكيل شده اند كه به ناحيه 3UTR,mRNA هدف متصل مي شوندو بيان ژن مورد نظر را در سطح رونويسي تنطيم منفي مي كند. ميكرو RNAها از طريق پنج مكانيسم متفاوت در بيماري زايي AML نقش دارند.تغييرات تعداد كپي ،تغييردر نزديك به ناحيه ژنومي انكوژنيك به دليل جا به جايي كروموزومي ، تغييرات اپي ژنتيكي هدف گيري نا به جاي نواحي پروموتر miRNA توسط فاكتورهاي رونويسي با انكوپروتيين هاي تغيير يافته ودر نهايت پردازش miRNAهاي نامنظم . با توجه به توضيحات فوق ومطالعات پيوسته اي كه بر روي عملكرد درماني miRNA داشتيم وبا استناد به پژوهش هاي پيشين مبتني بر افزايش بيان TIM3 در سلول هاي سرطاني AML بر آن شديم تا با به كار گيري آزمايش هاي علمي و دقيق تاثير miRNA-148a را بر بيان پروتيين TIM3در سرطان AMLمشاهده كنيم . با استفاده از پايگاه mirbase متوجه شديم miRNA148a مي تواند روي TIM3 تاثير داشته باشد.در اين مطالعه نقش miR-148aدر خاموش كنندگي TIM3 اندازه گيري شد. سلول هاي HL-60 كشت داده شده وبعد از تحريك با PMA بيان TIM3با دستگاه فلوسايتومتري اندازه گيري شد. ميزان بيان TIM3 بعد از ترانسفكشن با miR-148a به روش ريل تايم PCR نيز بررسي شده وميزان خاموش كنندگي اين ميكروRNA روي ژن TIM3 مشخص شد .نتايج ما نشان دا د كه miRNA-148a بركاهش ميزان بيان وپروتئين Tim3 تاثير به سزايي دارد.

Acute myeloid leukemia is a heterogenic malignant disease in which differentiation of cells is impaired and immature leukemic cells accumulate in blood circulation, bone marrow and other organs. In AML, Stem cells consist of hematopoietic and leukemic ones. Treatments of cancers such as chemotherapy just targets leukemic cells but does not affect on LSCs and LSCs continue to grow and produce leukemic cells and the disease relapses. There are some markers on the surface of LSCs that could be subjects for targeting such as Tim3. Tim3 just expresses on LSCs and could be silenced by using miRNAs. They are small non coding RNAs that can regulate gene expression by Inhibiting translation or mRNA cleavage. There are some bioinformatics programs that predict targets of miRNAs. Some of them indicate that miR-148a can target TIM3. In this study the role of miR-148a in silencing of tim3 was evaluated experimentally. HL-60 cell line was cultured and induced by PMA to express Tim3. On the next day expression of Tim3 was measured by flow cytometry. Then PMA threated cells were cultured in 24 well plate in four groups and transfected by miR-148a mimic, scramble FITC , transfection reagent and cell culture medium as negative control respectively. After a day scramble FITC group was observed by Fluorescent microscope and the next day the expression of Tim3 was evaluated by flow cytometery in all groups. Finally the mRNA of Tim3 was quantified by qPCR. Our results showed that miR-148a can reduce Tim3 in protein and mRNA s quantity significantly. Therefore bioinformatics prediction data were confirmed by experiment. Targeting of Tim3 could be considered as a therapeutic methods in some cancers and auto immune diseases by using miRNA or lock nucleic acids (LNA).