بررسي اثرات ژن كد كننده Buforin II بر بيان LncRNAهاي ANCR، GAS5 و UCA1 در سلول‌هايMCF-7

Study the effects of Buforin II coding gene on the expression of ANCR, GAS5 and UCA1 LncRNAs in MCF-7 cells

سابقه و هدف: سرطان پستان بيش از يك ميليون مورد از ده ميليون نئوپلازي را كه ساليانه در سراسر دنيا تشخيص داده مي‌شود به خود اختصاص مي‌دهد. اين سرطان شايع‌ترين سرطان بين زنان و دومين علت مرگ در زنان است. تنظيم ميزان بيان LncRNA نقش مهمي در آپوپتوز و كنترل سرطان پستان دارد. RNAهاي بلند غير كدكننده ANCR، GAS5 و UCA1 در القاي آپوپتوز نقش دارند. بوفورين II يك پپتيد 21 اسيد آمينه‌اي است. مطالعه حاضر اثرات تيمار با pcDNA3.1-Buforin II بر تغييرات سطح بيان ژن‌هاي ANCR، GAS5 و UCA1 در سلول‌هاي MCF-7 ترانسفكت شده با وكتور نوتركيب و وكتور فاقد ژن هدف را توصيف مي‌كند. مواد و روش‌ها: توالي ژن كد كننده Buforin II از سايت NCBI گرفته شد و با كمك سايت‌هاي Addgene و Snapgene در وكتور بياني pcDNA3.1(+) كلون شد. باكتري اشريشيا كلي سويه TOP10F توسط پلاسميد نوتركيب pcDNA3.1(+)-Buforin II ترانسفورم شد. پس از تكثير پلاسميد نوتركيب در باكتري، خالص سازي آن انجام گرفت. رده سلول‌هاي سرطاني MCF-7 به كمك ليپوفكتامين 2000 توسط وكتور نوتركيب و وكتور فاقد ژن هدف ترانسفكت شدند. از سلول‌هاي ترانسفكت شده استخراج RNA صورت گرفت و cDNA سنتز شد. سطح بيان ژن‌هاي ANCR، GAS5 و UCA1 با روش real-time PCR و محاسبه CtΔΔ تعيين شد. در مطالعه حاضر مقدار p كوچكتر از 05/0 به لحاظ آماري معني‌دار در نظر گرفته شد. يافته‌ها: نتايج حاصل از مطالعه حاضر نشان داد كه تيمار با pcDNA3.1-Buforin II پس از انكوباسيون 24 ساعته در دماي °C 37، سطح بيان ژن ANCR كه در مهار تكثير چرخه سلولي دخيل است را به طور معني‌داري كاهش داده (p˂0.01) شد. از طرفي تيمار با pcDNA3.1-Buforin II باعث افزايش معني‌دار بيان ژن‌هاي GAS5 (p˂0.001) و UCA1 كه در القاي آپوپتوز نقش دارند، گرديد (p˂0.0001). تيمار رده سلولي MCF-7 با وكتور فاقد ژن هدف هيچ گونه تغيير معني‌داري را نسبت به گروه شاهد نشان نداد. نتيجه‌گيري: پژوهش حاضر تأييد مي‌كند كه pcDNA3.1-Buforin II با تنظيم بيان ژن‌هاي ANCR، GAS5 و UCA1 مي‌تواند باعث القاي آپوپتوز شود. نتايج اين مطالعه به استفاده از بوفورين II به عنوان يك فاكتور درماني جديد و موثر براي كنترل احتمالي پيشرفت سرطان پستان كمك مي‌كند.

Background: Breast cancer accounts for more than one million cases out of ten million neoplasias diagnosed annually worldwide. This cancer is the most common cancer among women and the second leading cause of death in women. Regulation of LncRNA expression plays an important role in apoptosis and control of breast cancer. Long non-coding RNAs ANCR, GAS5 and UCA1 are involved in the induction of apoptosis. Buforin II is a 21 amino acid peptide. The present study describes the effects of treatment with pcDNA3.1-Buforin II on the expression level changes of ANCR, GAS5 and UCA1 genes in MCF-7 cells transfected with recombinant vector and free vector. Materials and Methods: The sequence of the Buforin II coding gene was obtained from the NCBI site and cloned into the expression vector pcDNA3.1(+) with the help of Addgene and Snapgene sites. Escherichia coli strain TOP10F was transformed by recombinant plasmid pcDNA3.1(+)-Buforin II. After multiplying the recombinant plasmid in bacteria, its purification was done. MCF-7 cancer cell line was transfected with lipofectamine 2000 by recombinant vector and vector without target gene. RNA was extracted from the transfected cells and cDNA was synthesized. The expression level of ANCR, GAS5 and UCA1 genes was determined by real-time PCR method and ΔΔCt calculation. In the present study, p value smaller than 0.05 was considered statistically significant. Results: The results of the present study showed that treatment with pcDNA3.1-Buforin II after 24 hours of incubation at 37 ℃, significantly reduced the expression level of ANCR gene, which is involved in the inhibition of cell cycle proliferation (p˂0.01). On the other hand, treatment with pcDNA3.1-Buforin II significantly increased the expression of GAS5 (p˂0.001) and UCA1 genes, which play a role in apoptosis induction (p˂0.0001). Treatment of MCF-7 cell line with the vector lacking the target gene did not show any significant changes compared to the control group. Conclusion: The present study confirms that pcDNA3.1-Buforin II can induce apoptosis by regulating the expression of ANCR, GAS5 and UCA1 genes. The results of this study help to use Buforin II as a new and effective therapeutic factor for the possible control of breast cancer progression.