توليد آزمايشگاهي فاكتور رشد اپيدرم انساني نو تركيب و ارزيابي عملكرد آن در بقاي سلولي

Production of Recombinant Human Epidermal Growth Factor and Assessment of its Activity in Cell Viability

سابقه و هدف: فاكتور رشد اپيدرم انساني (hEGF)، پلي پپتيدي داراي 53 اسيد آمينه است كه كاربردهاي وسيعي در پزشكي و به ويژه ترميم زخم دارد. هدف از اين پژوهش، همسانه سازي، بيان و تخليص hEGF نوتركيب و بررسي اثر ميتوژنيك آن بر دودمان سلولي NIH3T3 بود. مواد و روش‌ها: زيرهمسانه‌سازي ژن hEGF، درون وكتور pET24a صورت گرفت. بيان پروتئين تحت شرايط استاندارد صورت گرفت. از آن جايي كه بيان پروتئين به صورت كنجاله‌هاي نامحلول بود، محلول‌سازي ملايم با استفاده از بافري با pH قليايي صورت گرفت. در نهايت و پس از ايجاد تاخوردگي مجدد، اثر ميتوژنيك اين پروتئين در غلظت‌هاي مختلف بر دودمان سلول NIH3T3 مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: محلول‌سازي ملايم كنجاله‌هاي نامحلول با بافر قليايي و پس از آن انجام تاخوردگي مجدد داراي بازده بسيار بالايي بود. نتايج آزمون MTT، نشان داد كه سلول‌هاي تيمار شده با فاكتور رشد اپيدرمي بيان شده در اين تحقيق، پس از گذشت 72 ساعت، به طور معني‌داري درصد بقاء بيش‌تري نسبت به كنترل ((P < 0.0001). نشان دادند. استنتاج: به نظر مي‌رسد كه سيستم بيان سيتوپلاسمي به كار برده شده در اين تحقيق، براي توليد فاكتور رشد اپيدرم انساني نوتركيب زيست فعال كار آمد باشد. روش ارائه شده در اين تحقيق، روشي آسان، در دسترس، مقرون به صرفه و با بازده بالا براي محلول‌ سازي كنجاله‌هاي نامحلول و به دست آوردن شكل زيست فعال فاكتور رشد اپيدرم انساني مي‌باشد.

Background and purpose: Human epidermal growth factor (hEGF) is a polypeptide of 53 amino acids with various medical application such as wound healing. The purpose of this study was cloning, expression, and purification of recombinant human EGF (rhEGF) and assessment of its mitogenic effect on NIH 3T3 cells. Materials and methods: Subcloninig of hEGF was performed in to pET24a (+). Protein expression was done under standard conditions. According to the protein expression as inclusion body, mild solubilization using alkaline pH buffer was utilized for protein solubilization. Ultimately, after refolding of solubilized proteins, MTT assay was performed to assess the mitogenic effect of rhEGF in NIH 3T3 cells treated with various concentrations of rhEGF. Results: Mild solubilization of inclusion bodies with alkaline buffer and subsequent refolding had a very high efficiency. MTT assay showed that cells treated with our rhEGF exhibited significantly higher proliferation compared to control after 72 h (P < 0.0001). Conclusion: It seems cytoplasmic expression system is an efficient system for production of recombinant hEGF. The method presented in this study is a simple, accessible, affordable and of high efficiency for solubilization of inclusion bodies which is also helpful in achieving bioactive form of human epidermal growth factor.