كلونينگ ، بيان، خالص سازي و ارزيابي آنزيم ليزواستافين نوتركيب با استفاده از سيستم كلونينگ pBAD

Cloning, Expression, Purification and Evaluation of Recombinant Lysostaphin using pBAD Cloning System

سابقه و هدف: استافيلوكوك اورئوس يك پاتوژن مهم بيمارستاني بوده و باعث ايجاد بيماري‌هايي همچون اندوكارديت، استئوميليت، پنوموني، سندرم شوك سمّي و مسموميت غذايي مي‌گردد. امروزه استفاده بيش از حد و نامناسب از آنتي‌بيوتيك‌ها در درمان اين بيماري‌ها باعث مقاومت اين ارگانيسم به بسياري از آنتي‌بيوتيك‌ها شده است. ليزو استافين به عنوان يك عامل موثر و اختصاصي در درمان عفونت‌هاي استافيلوكوكي محسوب مي‌شود. هدف از اين مطالعه توليد ليزو استافين نوتركيب با استفاده از سيستم كلونينگ pBAD مي باشد. مواد و روش‌ها: در مرحله اوّل، ساخت پلاسميد نوتركيب pBAD با استفاده از سيستم pBAD/Thio-TOPO تحت عنوان pBADLys انجام گرفت. سپس به منظور بيان ژن ليزواستافين از آزمون Reverse Transcriptase PCR استفاده گرديد. در مرحله بعد، بيان ليزواستافين نو تركيب در سيستم pBAD انجام شد كه بيان پروتئين با ال - آرابينوز در غلظت نهايي 0/2 درصد القاﺀ گرديد. سپس خالص سازي آنزيم با استفاده از ستون Ni-NTA agarose (Qiagene, Hilden, Germany) انجام گرفت و در نهايت بررسي فعاليت آنزيمي با استفاده از محيط مولر هينتون آگار و ايجاد هاله عدم رشد مورد بررسي قرار گرفت. يافته‌ها: با توجه به نتايج حاصل شده از PCR و تعيين توالي، پلاسميد نو تركيب pBAD با موفقيت ساخته شد. بيان پروتئين با استفاده از ال - آرابينوز در غلظت نهايي 0/2 درصد به خوبي القاﺀ و غلظت بسيار بالايي از آنزيم نوتركيب با استفاده از سيستم كروماتوگرافي ستوني نيكل حاصل گرديد. ليزو استافين نوتركيب داراي فعاليت بسيار اختصاصي بر عليه استافيلوكوكوس اورئوس مي باشد. استنتاج: آنزيم ليزو استافين نوتركيب حاصل شده با استفاده از سيستم بياني pBAD با توجه به ميزان حاصل شده بسيار مقرون به صرفه از نظر هزينه مي باشد و همچنين با عملكرد اختصاصي بر روي استافيلوكوكوس اورئوس بسيار موثر است.

Background and purpose: Staphylococcus aureus is an important nosocomial pathogen which causes some diseases such as endocarditis, osteomyelitis, pneumonia, toxic shock syndrome, and food poisoning. The excessive and inappropriate use of antibiotics in the treatment of these diseases causes resistance to many antibiotics. Lysostaphin is an effective agent in the treatment of staphylococcal infections. The purpose of this study was to produce recombinant lysostaphin using pBAD cloning system. Materials and methods: In first phase, the recombinant plasmid pBAD was built using pBAD/ Thio-TOPO system (pBAD). Then, the gene expression of lysostaphin was determined by Reverse Transcriptase-test. Afterwards, the gene expression was induced by l (+) - arabinose to a final concentration of 0.2% and the expressed protein was purified by affinity- chromotagraphy using Ni-NTA agarose (Qiagen, Hilden, Germany). Finally, the enzyme activity was evaluated by Mueller Hinton agar medium and inhibition zone was measured. Results: The results of PCR and sequencing confirmed that the recombinant plasmid pBAD was created successfully. Protein expression using the l (+) - arabinose to a final concentration of 0.2% induced a very high concentration of the recombinant enzyme. Lysostaphin recombinant was found with highly specific activity against Staphylococcus aureus. Conclusion: Lysostaphin recombinant enzyme using pBAD expression system is very cost effective and highly active against Staphylococcus aureus.