طراحي و ساخت وكتور نوتركيب واجد ژن Vpr ويروس نقص ايمني اكتسابي انساني (HIV) با استفاده از وكتور EGFP-N1

Designing a Recombinant Construct of pEGFP-N1 Containing the Full Length of Human Immunodeficiency Virus-1 (HIV-1) Vpr Gene

سابقه و هدف: در اين پروژه، هدف كلي تحقيق طراحي و ساخت وكتور نوتركيب واجد ژن تمام طول Vpr ويروس نقص ايمني اكتسابي انساني (HIV-1) با استفاده از وكتور pEGFP-N1 بود. كلونينگ ژن Vpr قبلاً درون وكتور pEGFP_N1 صورت نگرفته بود. مواد و روش‌ها: وكتور pUC19 داراي ژن تمام طول Vpr جهت تاييد با استفاده از آنزيم‌هاي محدود كننده برش داده شد. سپس جهت اضافه كردن سايت‌هاي برش آنزيمي (XhoI, KpnI) در ژن مورد نظر مطابق با سايت هاي موجود در وكتور pEGFP-N1 با طراحي پرايمر واكنش PCR بر روي ژن Vpr با استفاده از پلاسميد نوتركيب pUC19-Vpr به عنوان الگو انجام گرفت. محصول پس از الكتروفورز، مورد استخراج از ژل قرار گرفته و تخليص گرديد. سپس هر دو محصول PCR و وكتور pEGFP-N1 تحت واكنش هضم آنزيمي قرار گرفتند. در مرحله بعد، واكنش الحاق توسط آنزيم T4 انجام گرفت و اين ژن به درون وكتور pEGFP-N1 كلون شده و به درون باكتري DH5a ترنسفورم گرديد. در نهايت سازه استخراج شده و با هضم آنزيمي و PCR مورد تاييد قرار گرفت. يافته‌ها: در اين پروژه ابتدا ژنVpr درون وكتور pUC19 پس از برش آنزيمي مورد تاييد قرار گرفت. سپس اين ژن به طور تمام طول و با قرار دادن توالي‌هاي برش از 2 آنزيم محدودالاثر در طراحي پرايمرهاي اختصاصي در واكنش PCR تكثير داده شد و اندازه محصول در الكتروفورز مورد تاييد قرار گرفت. محصول واكنش الحاق ژن Vpr به طور تمام طول در وكتور pEGFP-N1 نيز هم در هضم آنزيمي و هم در PCR مورد تاييد قرار گرفت. استنتاج: ساخت وكتور نوتركيب واجد ژن تمام طول Vpr ويروس نقص ايمني اكتسابي انساني با استفاده از وكتور pEGFP-N1 با موفقيت انجام گرفت.

Background and purpose: The purpose of this study was to design a recombinant vector pEFGP- N1 containing the full length of HIV-1Vpr gene. To the best of our knowledge, the cloning of Vpr gene in pEGFP_N1 is not previously done. Materials and methods: As a source of Vpr gene the pUC19-Vpr recombinant vector was confirmed by digestion with restriction enzymes BglII and NotI in order to separate the Vpr gene. The specific primers for Vpr gene including the restriction sites of XhoI and KpnI were designed according to the multiple cloning site of pEGFP-N1 and PCR reaction was performed using the pUC 19-Vpr vector as a template. The PCR product was undergone electrophoresis and gel extraction. Digestion reaction was done on both the extracted PCR product and the pEGFP-N1vector. The recombinant pEGFP-N1-Vpr vector was achieved by the ligation reaction using the T4 DNA ligase and it was transformed into the E-coli (DH5α) and propagated. Finally, confirmation was done through the restriction enzyme digestion and PCR amplification. Results: The recombinant vector pUC19-Vpr was confirmed using the restriction enzymes digestion, and then Vpr gene was successfully amplified using its specific primers including restriction sites for XhoI and KpnI. The PCR product was confirmed by electrophoresis. Finally, a recombinant vector pEGFP-N1 containing the full length of human immunodeficiency virus-1 Vpr gene (pEGFP-N1- Vpr) was successfully constructed. Conclusion: HIV-1 Vpr gene in its full length size could be ligated into the pEGFP-N1.