به كارگيري يك سري جديد پرايمرهاي دژنره براي جدا سازي هم‌زمان ناحيه بسيار متغير V3-Loop از ژنوتيپ‌هاي متفاوت HIV-1

Application of new degenerate primer set for simultaneous isolation of hyper variable subunit of ENV gene from distinct HIV-1 genotypes

زمينه و هدف: واكنش زنجيره پليمراز(PCR) رايج ترين تكنيك در عرصه زيست شناسي مولكولي است كه براي تكثير يك توالي اختصاصي اسيد نوكلئيك به كار مي‌رود. پرايمرهاي دژنره داراي توانايي تكثير توالي‌هاي وابسته اما متفاوت هستند. هدف مطالعه حاضر استفاده از دو جفت پرايمر دژنره در تركيب با Hemi Nested PCR براي تشخيص ناحيه V3-Loop ژن پوشش طيف وسيعي از ساب تايپ‌هاي ويروس HIV-1 است. مواد و روش ها: در مطالعه تجربي حاضر يك جفت پرايمر دژنره طراحي و بهينه سازي گرديد و در تركيب با Hemi Nested PCR براي تشخيص ناحيه V3-Loop ژن env طيف وسيعي از ژنوتيپ‌هاي ويروس HIV-1 كه داراي تغييرات نوكلئوتيدي بسيار شديد است استفاده گرديد. روش طراحي شده، برروي 40 نمونه سرم مثبت HIV، 10 كنترل منفي و ژنوم انساني و 5 نمونه از هر كدام از ويروس‌هاي HBV,HCV,HGV,TTV انجام شد. يافته‌ها: پس از بهينه سازي، در 35 مورد از 40 نمونه مثبت باند مورد نظر مشاهده شد. در هيچ يك از نمونه‌هاي كنترل منفي انساني و ويروسي هيچ باندي مشاهده نشد. علاوه بر آن در نمونه‌هاي مثبت باند غير اختصاصي تشكيل نشده بود. نتيجه گيري: در اين مطالعه علاوه بر PCR متداول، از دو پرايمر دژنره با قابليت اتصال به نواحي اختصاصي از ژنوم استفاده گرديد. در حقيقت محصولات PCR واكنش اول به عنوان DNA الگو براي يك جفت پرايمر داخلي مورد هدف قرار مي‌گيرد و منجر به توليد محصولاتي با اندازه‌هاي كوچك‌تر و با حساسيت بالاتر به دليل دژنره بودن، خواهد بود. بر اساس يافته‌هاي مطالعه، روش طراحي شده داراي مزيت‌هايي شامل تأييد محصولات اوليه و افزايش حساسيت روش تشخيص مي‌باشد.

Background: Polymerase chain reaction is the most common technique in the field of molecular biology that use for amplification of a specific nucleic acid sequence. Degenerate primers have ability to amplify related but distinct sequences. The aim of current study was to use, two sets of degenerate primers in combination with Hemi Nested PCR for detection V3-Loop sequence of envelope gene from wide spectrum of Human Immunodeficiency Virus (HIV) subtypes. Material and Methods: In this experimental study we designed and optimized, a degenerate primer pair in combination with Hemi Nested PCR, to detect HIV-1 V3 loop from Envelop gene that has wide variations among genotypes. The developed assay was used to check, 40 HIV infected, 10 negative controls as well as 5 samples from each HCV, HBV, HGV, and TTV were analyzed using developed method. Results: after optimization, 35 out of 40 positive controls were positive using our test. None of the negative human and viral control samples showed specific band. Also, in positive samples, non-specific bands were not detected. Conclusion: In this study moreover than standard PCR, we used two degenerate primers that could detect specific region of genome. In fact, first round of PCR product act as a template for second round inner primers and can produce smaller sequence with high sensitivity due to degeneracy. Based on the current investigation, the developed assay had advantages including product confirmation and hence more sensitivity.