بهينه سازي توليد آنزيم استرپتوكيناز نوتركيب در باكتري اشريشا كلي

Improvement of recombinant streptokinase production in E.coli

زمينه و هدف: استرپتوكيناز از جمله پروتئين هاي ترشحي استرپتوكك پيوژن است. اين پروتئين در بيماريزايي باكتري نقش مهمي دارد. در اين تحقيق سعي بر توليد بالاي اين آنزيم به شكل نو‌ تركيب بوده به‌طوري‌كه محصول با تغيير تركيب محيط كشت و تعداد باكتري القاء شده افزايش يابد. مواد و روش ها: در اين مطالعه تجربي، با استفاده ازروش PCR، ژن استرپتوكيناز از استرپتوكوك پيوژن تكثير گرديد. پس از تخليص، ژن در ناقل پلاسميدي pET32a جهت بيان كلون گرديد. سپس ساختار پلاسميدي pET32a -Ska وارد باكتري اشريشياكلي سويه BL21- DE3-plySs شد. توليد پروتئين با القاء توسط IPTG و بهينه سازي شرايط محيط كشت و تعداد باكتري‌ها صورت گرفت. پروتئين نوتركيب با استفاده از كيت Ni-NTA خالص و ميزان پروتئين با استفاده از روش برادفورد اندازه‌گيري شد. آزمايش وسترن بلات براي تاييد پروتئين نوتركيب انجام شد. يافته ها: ترادف نوكلئوتيدي ژن تكثير شده با ژن استرپتوكيناز باكتري استرپتوكوك پيوژن يكسان بود. توليد پروتئين نوتركيب استرپتوكيناز با القاء پلاسميد pET32a -Ska توسطIPTG انجام گرديد. پروتئين توليد شده از نظر آنتي ژنيسيته با فرم طبيعي يكسان بود. بيشترين مقدار پروتئين توليد شده در غلظت باكتري با جذب نوري 8/0 بود. در محيط فاقد گلوكز نسبت به محيط‌هاي گلوكز دار پروتئين بيشتري توليد شد. نتيجه گيري: تغيير شرايط محيط كشت مي‌تواند باعث افزايش ميزان توليد پروتئين‌هاي نوتركيب در باكتري ميزبان گردد. وجود برخي عوامل غذايي از جمله گلوكز به تنهايي باعث افزايش محصول نمي شود بلكه امكان دارد كاهش محصول را نيز در پي داشته باشد.

Background: Streptokinase is one of the antigenic proteins secreted by streptococcus pyogenes. This protein has an important role in bacterial pathogenesis. The aim of this study was to produce recombinant forms of this enzyme so that the product would change in accordance with changes in the media. Materials and Methods: In this experimental study, we amplified the streptokinase gene by polymerase chain reaction (PCR) method. After extraction, it was sub-cloned to prokaryotic expression vector pET32a. pET32a-Ska was transferred to E.coli BL21-DE3-plySs strain. Protein production was induced by IPTG and optimization of culture media and OD of bacteria. The recombinant protein was extracted by Ni-NTA and its concentration was measured by Bradford assay. Western- Blot analysis was used to verify the recombinant protein. Results: The nucleotide sequence of the amplified gene was the same as streptokinase gene of the streptococcus pyogenes. The production of recombinant streptokinase by induction of plasmid pET32a-Ska was done by IPTG. The recombinant streptokinase had the same antigenic properties as natural streptokinase. The largest amount of recombinant protein was produced in bacteria concentrations with OD = 0.8. Also, the production of the recombinant protein was higher in media with no glucose. Conclusion: Changes in culture media can increase the production of recombinant proteins in host bacteria. The presence of nutrients, such as glucose, alone not only can not increase the amount of production but it might even decrease it