بهينه‌سازي تشخيص همزمان سالمونلا و اشرشياكلي O157:H7 در فرآورده‌هاي گوشتي و بررسي ميزان آلودگي با روش Multiplex PCR

Optimization of a Multiplex PCR for Simultaneous Detection of Foodborne Pathogens Salmonella spp. and Escherichia coli O157:H7 and Contamination Prevalence Assay in Meat Products

زمينه و هدف: سالمونلا و اشرشيا كلي از مهم ترين پاتوژن­هاي آلوده­كننده مواد غذايي به­ ويژه فرآورده­هاي گوشتي هستند. تشخيص سريع، اختصاصي و همزمان اين پاتوژن­ها با انتخاب و بهينه­سازي ژن­هاي اختصاصي از اهميت بالايي برخوردار است. اين مطالعه با هدف تشخيص توأم سالمونلا و اشريشيا كلي O157:H7 در فرآورده­هاي گوشتي و بررسي ميزان آلودگي بر مبناي تكثير دو ژن rfbE و invA با روش Multiplex PCR در استان زنجان واقع در شمال غربي ايران انجام گرفت. مواد و روش­ها: تعداد 74 نمونه گوشت به صورت تصادفي از نواحي مختلف استان زنجان جمع­آوري شد. 25 گرم از هر نمونه گوشت در 225 ميلي­ليتر محيط مولر هينتون براث به طور كامل يكنواخت­سازي و گرماگذاري گرديد. جدايه­هاي باكتري خالص­سازي شد و استخراج DNA انجام گرديد. تكثير همزمان قطعات ژني rfbE و invA با استفاده از پرايمرهاي اختصاصي و با بهينه­سازي واكنش PCR چندگانه انجام گرفت. در نهايت، حساسيت اين روش با تلقيح رقت­­هاي مختلف از باكتري­ها به نمونه­هاي گوشتي بررسي گرديد. يافته‌ها: از بين 74 نمونه گوشتي، تعداد 6 نمونه (1/8 درصد) به اشريشيا كلي O157:H7، تعداد 4 نمونه (4/5 درصد) به سالمونلا و تعداد 2 نمونه (7/2 درصد) به هر دو باكتري آلوده بودند. واكنش PCR چندگانه در تشخيص توام هر دو پاتوژن در كمترين رقت تلقيح شده به نمونه­هاي گوشتي نيز از حساسيت بالايي برخوردار بود. نتيجه‌گيري: در اين مطالعه، واكنش PCR چندگانه بر اساس ژن­هاي بيماري­زايي سالمونلا و اشريشيا كلي O157:H7 جهت تشخيص سريع و همزمان اين پاتوژن­ها با حساسيت و اختصاصيت بالا بهينه شد. واكنش PCR چندگانه به منظور شناسايي همزمان پاتوژن­هاي منتقله از راه غذا در كنترل آلودگي­هاي مواد غذايي روش قابل اعتمادي است.

Background: Salmonella spp. and Escherichia coli O157:H7 are the most common bacterial foodborne pathogens contaminating food products especially meat. It is essential to detect the pathogens rapidly, specifically, and simultaneously by selection and optimization of suitable reference genes. The present study was conducted to simultaneously detect E. coli O157:H7 and Salmonella spp. in meat products and contamination prevalence assay by using multiplex PCR based on rfbE and invA genes amplification in Zanjan province, northwest of Iran. Materials and Methods: A total of 74 meat samples were obtained from various regions of Zanjan province, randomly. 25 grams of each meat sample was completely homogenized in 225 ml of Mueller-Hinton broth growth medium and incubated. Bacterial strains were purified and DNA extraction was performed from purified bacterial isolates. Simultaneous amplification of rfbE and invA gene fragments was done with specific primers by optimization of a multiplex PCR. Finally, the sensitivity of the method was evaluated by inoculation of the bacteria to the meat. Results: Out of 74 meat samples, 6(8%), 4(5.4%), and 2(2.7%) samples were positive for E. coli O157:H7, Salmonella, and both E. coli O157:H7-Salmonella, respectively. Multiplex PCR indicated high sensitivity for simultaneous detection of the pathogens in lowest dilution of the bacteria that had been inoculated to the meat. Conclusion: In this study, a multiplex PCR was optimized based on Salmonella spp. and E. coli O157:H7 virulence genes for rapid and simultaneous detection of the pathogens with high sensitivity and specificity. Multiplex PCR as a reliable tool for rapid and simultaneous detection of foodborne pathogens to prevent contamination of food products.