طراحي سيستم اليزاي غيرمستقيم با استفاده از پادگن هاي ترشحي مايكوباكتريوم آويوم زيرگونه پاراتوبركلوزيس براي تشخيص پاراتوبركلوزيس

Designing of Indirect ELISA system using secreted antigens of Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis for Diagnosis of paratuberculosis

زمينه و اهداف: مايكوباكتريوم آويوم زيرگونه پاراتوبركلوزيس (MAP)، عامل به وجود آورنده پاراتوبركلوزيس است كه به عنوان بيماري يون نيز ناميده مي شود و علت ضررهاي اقتصادي جبران ناپذير در صنعت دامپروري به حساب مي آيد. جهت تشخيص آلودگي به پاراتوبركلوزيس، اليزاي غيرمستقيم به عنوان يك روش ساده با حساسيت و ويژگي بالا بيشتر مورد توجه بوده است. از اين رو هدف از اين مطالعه طراحي يك سيستم اليزاي غيرمستقيم جهت تشخيص بيماري پاراتوبركلوزيس مي باشد. مواد و روش كار: تعداد 100 نمونه سرم از 10 گله در سال 1394 در استان هاي تهران و البرز كه پاراتوبركلوزيس توسط كشت در آن ها به اثبات رسيده با كيت استاندارد مورد مطالعه قرار گرفت و سيستم داخلي مطابق كيت استاندارد طراحي گرديد. جهت طراحي سيستم اليزا با استفاده از پادگن هاي ترشحي، سرم مثبت و منفي واقعي پليت متقاطع تيتراسيون انجام گرفت. جهت تعيين حد آستانه از نتايج كيت خارجي به عنوان استاندارد طلايي استفاده شد. يافته ها: با در نظر گرفتن نتايج (15 نمونه مثبت و 85 نمونه منفي) در ارزيابي هاي كيت تجاري، بهترين غلظت پادگن و رقت پادتن در سيستم طراحي شده به ترتيب 1/2 ميكروگرم و 1/100 به ترتيب در هر چاهك ارزيابي شد. علاوه بر اين، ميزان حد آستانه برابر با 0/44 مشخص گرديد. حساسيت و ويژگي به ترتيب 100 و 70 درصد ارزيابي شد. نتيجه گيري: پادگن هاي ترشحي مايكوباكتريوم پاراتوبركلوزيس حساسيت لازم را جهت تشخيص بيماري ايجاد مي كنند، اما تشخيص باكتري از مدفوع در مراحل اوليه بيماري، مشكل است. بنابراين با استفاده از اليزاي غيرمستقيم طراحي شده مي توان پادتن را در مراحل اوليه بيماري رديابي كرد.

Background and Aim: Mycobacterium avium subsp. paratubercuiosis (MAP) is the causative agent of paratuberculosis, also called as Johne's disease and is considered as the cause of irrecoverable economic losses in livestock industry. For the detection of the paratuberculosis, indirect ELISA has been highly considered as a simple method with high sensitivity and specificity. Accordingly, this study aims at designing a system of indirect ELISA for the detection of paratuberculosis. Materials and Methods: A total of 100 serum samples from 10 herds, in Tehran and Alborz provinces in 2015, in which paratuberculosis has been proven by culture, were selected and surveyed using the standard kit and the internal system was designed according to the standard kit. To design ELISA system, by using secretory antigens and confirmed positive and negative serum samples were used and checkerboard titration was performed. To determine the cutoff point, the results of the commercial kit were used as gold standard. Results: According to the commercial ELISA kit results (15 positive samples and 85 negative samples), the best concentration of antigen and antibody dilution were evaluated as 1.2 µg and 1.100 per well, respectively. Furthermore, the cutoff point was determined as 0.44. The sensitivity and specificity were evaluated as 70% and 100%, respectively. Conclusions: Secreted antigens in M. avium subsp. paratubercuiosis are sensitive to detect the infected animals but it is difficult to detect bacteria from feces in the early stages of disease. Therefore, by using indirect designed ELISA, it can be detected antibodies in the early stages of the disease.