طراحي بيوانفورماتيكي و ساخت ژن كايمر دربردارنده زير واحد B كلراتوكسين و زير واحد A پيلي ويبريو كلرا

Insilico Design and Construction of a Chimeric Gene Comprising the A Subunit of Vibrio cholera Pilin and the B Subunit of Cholera Toxin

زمينه و اهداف: وبا بيماري خطرناكي است كه توسط ويبريو كلرا ايجاد مي شود. فاكتور كلونيزاسيون پيلي Toxin-coregulated pili A (tcpA) و توكسين كلرا مهم ترين عوامل بيماري زايي ويبريوكلرا مي باشند. زير واحد B انتروتوكسين Cholera toxin subunit B (ctxB)مسئول اتصال سم به سلول يوكاريوتي است و tcpA كه براي كلونيزاسيون باكتري ضروري است، ويژگي هاي ايمونوژنيك دارند. پروتئين هاي كايمر دربردارنده اپي توپ و ادجوانت، مي توانند سبب افزايش خاصيت ايمونوژنيسيتي پروتئين ها شوند و سبب بروز پاسخ هاي ايمني گردند. هدف از تحقيق طراحي ايمنوژن كايمر عليه فاكتورهاي اتصال و توكسين ويبريو كلرا بود. مواد و روش كار: ژن ctxB و tcpA به لحاظ وجود كدون هاي نادر در سال 95 مورد بررسي قرار گرفتند و بهينه سازي ژن ها انجام شد. نيمه عمر و شاخص ناپايداري پروتئين تعيين گرديد. ساختارهاي دوم و سوم پروتئين پيش بيني و ارزيابي شد. اپي توپ هاي خطي و فضايي نيز تعيين گرديد. پلاسيمد نوتركيب به سلول هاي مستعد منتقل و بيان پروتئين با استفاده از IPTG القا گرديد. بيان پروتئين با روش SDS-PAGE وسترن بلاتينگ ارزيابي شد. يافته ها: شاخص ناپايداري پروتئين كايمر 24/04 بود. شاخص سازگاري كدون سازه كايمر به 0/9 افزايش يافت. ساختار سوم پيش بيني شده نيز كيفيت مناسبي را داشت و mRNA آن نيز پايدار بود. اپي توپ هاي فضايي و خطي در هر دو دومين پروتئين كايمر ديده شد. آناليز همسانه سازي، پلاسميد نوتركيب واجد ژن كايمر را تائيد كرد. بيان پروتئين نوتركيب از ژن سنتزي منجر به توليد پروتئيني با وزن 37 كيلو دالتون شد. نتيجه گيري: با توجه به نتايج بررسي هاي بيوانفورماتيكي و بيان پروتئين نوتركيب مي توان از آن به عنوان ايمونوژن جهت بررسي هاي ايمني عليه وبا استفاده شود.

Background and Aims: Cholera is a lethal diarrheal disease that cause by Vibrio cholerae. Cholera toxin and colonization factor pili (tcpA) are the major virulence factor in V.cholerae pathogenesis. The B subunit of the enterotoxin )ctxB) which is responsible for toxin binding to eukaryotic cells and toxin-coregulated pili A (tcpA) that is essential for V.cholerae colonization, have immunogenic properties. Chimeric proteins carrying epitopes, linkers or adjuvant sequences could increase immunogenicity for recombinant antigens and can also elicit broad immune responses. The aim of this study was to design am immunogen against adherence and toxicity of V.cholorae. Materials and Methods: ctxB and tcpA genes were analyzed for rare codons and gene optimization was performed using optimization software In 2017. The half-life and protein instability index was determined. Secondary and tertiary structure was predicted and evaluated. Linear and conformational epitopes were predicted. Recombinant pET28a/chimeric gene plasmid was transformed to E.coli BL21 DE3 and expression was induced with Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG). The protein expression was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Results: Chimeric protein instability index was 24.04 and the codon adaptation index of chimeric constructs increased to 0.9. The tertiary predicted structure of the chimeric proteins confirmed and mRNA was stable. Conformational and linear epitopes were seen in both domains of the chimeric protein. Restriction analysis confirmed cloning of the gene into pET28a vector. Expression of recombinant protein in E.coli led to the production of chimeric protein with 37 k Da molecular weight. Conclusions: According to the results of bioinformatics and recombinant protein expression, the design chimeric protein could be used as an immunogen to evaluate the immunity against cholera.