بررسي ويژگي هاي سلول هاي استئوبلاست انساني در دو روش كشت تك لايه اي و كشت سه بعدي هيدروكسي آپاتيت- تري كلسيم فسفات

The Comparison of Characteristics of Human Osteoblast Cells in Two Methods, Monolayer Culture and Hydroxyapatite-Tricalcium Phosphate Scafold

بيماري ها و آسيب هاي استخواني شامل شكستگي هاي استخواني در طي تصادفات و تروما در همه جوامع شيوع فراواني دارد و در اكثر موارد استخوان خرد شده قادر به ترميم نيست؛ به علاوه، روش هاي درماني مورد استفاده نظير پيوند بافت استخواني به صورت آلوگرافت و اتوگرافت خطرات و مشكلاتي را به دنبال دارد. يكي از راه هاي درمان، استفاده از سلول هاي استخواني خود فرد، كشت آن ها بر روي داربست مناسب و انتقال به بيمار مي باشد. در اين مطالعه، ضمن كشت سلول هاي استئوبلاست به صورت تك لايه اي و داربست هيدروكسي آپاتيت-تري كلسيم فسفات (HA-TC)، رفتار اين سلول ها در دو نوع كشت متفاوت مورد بررسي قرار گرفت. روش ها: در جريان عمل جراحي كرانيوتومي در بيمارستان الزهراي (س) اصفهان از 5 فرد نمونه استخواني تهيه و به روش استريل به آزمايشگاه ارسال شد. هر نمونه پس از شستشو با PBS به قطعات كوچك تقسيم و پس از قرار دادن در پليت محتوي محيط كشت به انكوباتور منتقل گرديد. در روز 12-10 سلول ها شروع به خروج از استخوان نموده، پس از پوشاندن كف پليت با استفاده از آنزيم Trypsin_EDTA ازكف پليت جدا شد و به دوگروه تقسيم گرديد. در گروه اول، سلول ها بر داربست HA-TC و در گروه ديگر به صورت تك لايه اي كشت داده شدند. رنگ آميزي Van kossa، شمارش سلولي، روش MTT، رنگ آميزي آلكالين فسفاتاز و روش فلوسايتومتري جهت بررسي ويژگي هاي سلول هاي استئوبلاستي به كار گرفته شد. يافته ها: در كشت سلول ها به صورت تك لايه اي، سلول هايي با مورفولوژي فيبروبلاستي و يا دوكي مشاهده شد. با رنگ آميزي Van kossa وجود رسوبات مواد معدني در دو گروه مشخص گرديد. ميزان تكثير سلولي در داربست HA-TC نسبت به تك لايه اي بيشتر بود ( .(P<0.001ميزان فعاليت سلول هاي زنده نيز در داربست HA-TC نسبت به تك لايه اي بيشتر بود ( .(P<0.001در رنگ آميزي آلكالين فسفاتاز وجود گرانول هاي آبي مشاهده شد؛ در فلوسايتومتري در كشت اوليه 57 درصد سلول ها در پاساژ سوم 5 درصد سلول ها فعاليت آلكالين فسفاتازي از خود نشان دادند. نتيجه گيري: با توجه به نتايج تحقيق حاضر مي توان گفت كه داربست هيدروكسي آپاتيت- تري كلسيم داربست مناسب تري براي كشت سلول هاي استئوبلاستي نسبت به كشت تك لايه اي است. احتمال مي رود علت اين باشد كه داربست هيدروكسي آپاتيت- تري كلسيم حاوي كلسيم و اجزاي مشابه ماتريكس استخواني است و وجود تخلخل و منافذ مناسب در اين داربست موجب تسهيل تغذيه سلول ها نسبت به كشت تك لايه اي مي شود.

Background: Bone diseases and injuries, including bone fractures during accidents and trauma, in all communities are prevalent and in most cases, crushed bone is not able to repair; various treatment ways including tissue graft from an allograft or autograft have risks and lead to problems. One method for treatment of bone fractures is using outologous osteoblasts with culturing on suitable scaffolds and then implant of cells to defect region. In this study, we cultured osteoblast cells on monolayer and calcium phosphate hydroxyapatite (HA-TC) scaffolds and the behavior of these two types of cells in different cultures were analyzed. Methods: During the craniotomy operation in Alzahra hospital in five individual, bone samples were obtained and in sterile condition were sent to the laboratory. Each sample after washing with PBS was cut into small pieces and plates containing the medium culture were transferred to the incubator. After 10-12 days, the cells have started to leave the bones covering the floor plate and after using the enzyme Trypsin_EDTA isolated from plate divided into two groups. One group was cultured in HA-TC scaffold and other as monolayer culture. Van kossa staining, flow cytometry, alkaline phosphatase assay and MTT method were used to investigate the characteristics of osteoblasts. Finding: Osteoblasts in monolayer culture were observed as fibroblast- like cells. Van kossa staining determined the mineral deposits in the two groups. The cell proliferation increased in cellular scaffolding HA-TC more than monolayer (P < 0.001). Results of MTT showed more activity items on living cells in scaffold HA-TC than monolayer (P < 0.001). In alkaline phosphatase staining, blue granules were observed; in the flow cytometry, 57 percent of primary cultured cells and 5 percent in the third passage cells showed alkaline phosphatase marker. Conclusion: According to the results of this study, the hydroxyapatite scaffold is better than monolayer culture for osteoblast cells. This could be because of having more calcium and similar elements to bone matrix that facilitate feeding cultured cells.