كلونينگ و بيان ژن hly Listeria monocytogenes در Lactococcus lactis

Cloning and expression of Listeria monocytogenes hly in Lactococcus lactis

ژن hly يكي از مهم‌ترين عوامل ويرولانس Listeria monocytogenes مي‌باشد كه پروتئين ليستريوليزين (O (LLO را رمزگذاري مي‌كند. LLO يك پروتئين ايمونوژن با قابليت بالاست، كه قادر به برانگيختن ايمني سلولي و هومورال است و علاوه بر فعاليت هموليتيك، عملكردهاي متعدد ديگري نيز دارد. اين پروتئين با تخريب فاگوليزوزوم به فرار باكتري از سيتوپلاسم، زنده ماندن و رشد درون سلوليL. monocytogenes كمك مي كند.از طرفي Lactococcus lactis سويه اي از باكتريهاي اسيد لاكتيك مي‌باشد كه براي بيان پروتئين‌هاي نوتركيب كاربرد زيادي دارد. هدف ما در اين تحقيق بيان آنتي ژن نوتركيب LLO در سويه L. lactis بود.كه اين كاردر ابتدا با واسطه پلاسميد pTG19-T (وكتور T/A كلونينگ) و سپس با استفاده از پلاسميد pNZ8110 كه مربوط به سيستم پلاسميدهاي بياني ترشحي مختص L. lactis مي‌باشد، انجام گرديد. ژن hly، با طراحي محل برش آنزيم‌هاي محدود‌كننده در دو سر ژن، وارد پلاسميد شده و پس از كلونينگ و تكثير در E. coli MC1061 بعنوان ميزبان واسط با روش الكتروپوريشن وارد L. lactis گرديده و در نهايت پروتئين LLO بيان گرديد. بيان اين پروتئين با استفاده از روش SDS PAGE و وسترن بلات تاييد شد.

The hly gene is one of the most important virulence factors of Listeria monocytogenes encoding listeriolysin O (LLO). LLO is a potent immunogenic protein eliciting both cellular and humoral immunity and has manyother functions besides hemolytic activity. This protein mediates the bacterial escape to the cytoplasm by disruption of phagosomal membrane leading to intracellular survival and proliferation of L. monocytogenes. On the other hand, Lactococcus lactis is a lactic acid bacterium which has many applications in expression of recombinant proteins. Our aim in this study was expression of recombinant LLO in L. lactis strain. Initially, the pTG19-T plasmid which is a T/A cloning vectorwas employed and then pNZ8110 was used as a Lactococcal secretional expression plasmid to clone L. monocytogenese hly gene by restriction enzymes cutting and ligation method. After cloning and propagation in E. coli MC1061 intermediate host, it was electro-transformed into L. lactis. Expression of LLO was confirmed by SDS-PAGE and western blot.