توليد آلبومين سرم انساني نوتركيب در مخمر متيلوتروف هانسونلا پلي مورفا

Expression of recombinant human serum albumin in the methylotrophic yeast; Hansenula polymorpha

سابقه و هدف ‌ آلبومين عمده‌ترين پروتئين پلاسما مي‌باشد. اين پروتئين نه تنها به عنوان حامل بسياري از ماكروملكول‌ها در بدن نقش عمده‌اي ايفا مي‌كند بلكه نقش مهمي در تنظيم فشار اسمزي دارد. امروزه از آلبومين در درمان خونريزي‌ها و سوختگي‌هاي شديد و هم‌چنين در درمان افراد مبتلا به كمبود آلبومين استفاده مي‌شود. مصرف ساليانه آلبومين در دنيا حدود 450 تن مي‌باشد. به‌منظور برطرف كردن اين نياز و توليد آلبومين عاري از هرگونه آلودگي از روش‌هاي بيوتكنولوژي استفاده گرديده است. در اين تحقيق از مخمر هانسونلا پلي مورفا كه امروزه در سطح وسيعي به ‌منظور توليد پروتئين‌هاي هترولوگ به‌كار برده مي‌شود،‌ براي آلبومين انساني نوتركيب استفاده گرديده است. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربي (experimental) است. به‌منظور توليد پروتئين آلبومين نوتركيب و هم‌چنين بهينه ‌سازي شرايط توليد از سوش RB-11 هانسونلا پلي ‌مورفا به ‌عنوان ميزبان استفاده گرديد. پلاسميد pFMPT-MFα حاوي cDNA آلبومين تحت كنترل پروموتور FMD با استفاده از روش الكتروپوريشن داخل ميزبان شد و سپس تحت شرايط مختلف با بررسي پارامترهايي نظير زمان انكوباسيون، محيط كشت، دما و مهاركننده‌هاي پروتئازي بيان آلبومين مورد بررسي قرار گرفت. آلبومين توليد شده با روش‌هايي هم‌چون الايزا، HPLC و Western Blot ارزيابي شد. يافته‌ها درطي اين تحقيق چهارعامل مهم دربيان پروتئين آلبومين موردمطالعه قرارگرفت ومشخص گرديد كه از بين سه محيط derepression ، YNB 1% Glycerol ، YP 1% Glycerol ،‌ YNB 1% Glycerol with buffer ، محيط كشت YNB 1% Glycerol with buffer و از بين سه دماي 25،‌30 و37 درجه سانتي گراد دماي 37 درجه و از بين سه زمان انكوباسيون، 24، 48 و 72 ساعت، مدت 48 ساعت با حضور آنتي ‌پروتئازها بيشترين ميزان توليد آلبومين به‌دست آمد. نتيجه گيري بالاترين ميزان توليد شده تحت شرايط بهينه به‌دست آمده در مقياس آزمايشگاهي، mg/17/6 را نشان داد. از سوي ديگر با استفاده از اين سوش در شرايط نيمه صنعتي، ميزان mg/l 478 آلبومين توليد شد و اين امر نشان‌دهنده آن است كه مي‌توان توليد پروتئين آلبومين را در شرايط انبوه ادامه داد.

Background and Objectives Human serum albumin (HSA) is the major protein component of human plasma. It plays a very important role in transporting of macro molecules and maintaining the normal osmolarity. It is used as a therapeutical protein in patients with hypoalbuminemia and acute bleeding and burning. Albumin consumption in the world is about 500 ton/year. The aim of this research is to study the production of rHSA in shake flask culture by Hansenula polymorpha. Materials and Methods H. polymorpha was used for the production of recombinant human serum albumin (rHSA) in several of shake flask culturing; expression of rHSA was investigated relating several parameters affecting the expression of HSA. To optimize the secretory expression of rHSA under the control of FMD promoter in H. polymorpha RB-11 incubation time, culture media temperature and protease inhibitors were analyzed. Results This study not only established production of rHSA in yeast but also analyzed the correlation between affecting parameters and the level of HSA expression. Comparison of the HSA levels in the culture supernatants showed that the highest HSA yield was 17.6mg/l. The research shows that among three different temperatures (25oC,30oC and 37oC) 37oC was the best temperature and amongst three different incubation times (24h,48h and 72h) 48h was the optimum time and YNB 1% glycerol with buffer was the best derepression medium in comparison with others. Conclusions Using these optimized conditions, stable production of rHSA of around 17.6mg/l was achieved. Our results suggest that affecting experssion factors improved in this study are suitable for production of recombinant albumin.