روش اصلاح شده PCR-RFLP براي تشخيص جهش JAK2 V617F در بيماران مبتلا به نئوپلاسم‌هاي ميلوپروليفراتيو

Modified PCR-RFLP for detection of JAK2V617F mutation in patients with myeloproliferative neoplasm

سابقه و هدف نئوپلاسم‌هاي ميلوپروليفراتيو، از جمله بدخيمي‌هاي خوني هستند كه علايم باليني بسيار متغيري دارند. تقسيم‌بندي بيماران ميلوپروليفراتيو به دو گروه داراي كروموزوم فيلادلفيا (Ph+) و فاقد آن (Ph-) مي‌باشد. در گروه Ph- ، بيماري­هاي پلي‌سايتمي‌ورا، ترومبوسايتمي اساسي، ميلوفيبروز اوليه و ديگر بيماري‌هاي نادر قرار مي­گيرد. اين گروه از بيماران داراي جهش JAK2 V617F مي ­باشند كه با درصدهاي مختلف ديده مي­شود. هدف از اين مطالعه، اجراي روش اصلاح شده PCR-RFLP براي تشخيص جهشJAK 2 V617F در بيماران مبتلا به نئوپلاسم‌هاي ميلوپروليفراتيو بود. مواد و روش‌ها در اين مطالعه مقطعي، 47 بيمار با درخواست آزمايش JAK2 V617F ، مورد بررسي قرار گرفتند. براي تمامي نمونه­ ها آزمايش تشخيصي JAK2 V617F با استفاده از روش استاندارد ARMS TaqMan Probe انجام شد. جهت تاييد نهايي، برخي از نمونه­ ها مورد توالي‌يابي ژني قرار گرفتند. براي شناسايي ناحيه جهش با استفاده از روش PCR-RFLP ، آغازگر­هاي اختصاصي و آنزيم BsaXI استفاده شد. با توجه به اين كه در اين مطالعه نمونه ­هاي منفي و مثبت به همراه يك روش استاندارد براي تعيين جهش وجود داشت، محاسبه حساسيت و ويژگي اين روش 100% تعيين گرديد. تحليل نتايج توسط آزمون t انجام شد. يافته‌ها نتايج PCR-RFLP جهش JAK2 V617F براي تمامي نمونه­ ها كاملاً مشابه و منطبق با نتايج روش­هاي استانداردARMS TaqMan Probe و تعيين توالي بود. نتيجه گيري روش PCR-RFLP داراي حساسيت تشخيصي قابل مقايسه ­اي با روش­هاي Real Time PCR و تعيين توالي بود. مزيت اين روش اصلاح شده، توانايي آن در افتراق انواع هموزيگوت و هتروزيگوت بيماران، وجود كنترل داخلي براي عملكرد آنزيم و هم چنين سهولت و صرفه اقتصادي آن است.

Background and Objectives Chronic myeloproliferative neoplasms (MPNs) are clonal hematopoietic stem cell disorders. They are heterogeneous in symptoms and mainly consist of Philadelphia chromosome positive (Ph+) and negative (Ph-). The Ph- group includes polycythemia Vera (PV), essential thrombocythemia (ET), primary myelofibrosis (PMF) and other rare disorders. In the latter group, substitution of phenylalanine for valine at codon 617 (JAK2V617F), could be relevant to the disease. In this study we used modified PCR-RFLP to detect JAK2 V617 F mutation in chronic myeloproliferative neoplasms. Materials and Methods In this cross sectional study, for detection of JAK2 V617 F mutation, 47 subjects were enrolled and peripheral blood samples were collected between 2015 and 2016. The samples were collected from the clinic center of Arak city and diagnosed to be JAK2 V617F positive by TaqMan probe and sequencing methods. All samples were investigated for the mutation by modified PCR-RFLP using specific primers and BsaXI restriction enzyme. The data were analyzed by t-test. Results Our modified PCR-RFLP for detection of JAK2 V617F mutation showed the same results as TaqMan probe and sequencing standard methods. In this study we have positive and negative samples and a standard method whose sensitivity and specificity was calculated to be 100% . Conclusions Our modified PCR-RFLP is a comparable method with gold standard methods, TaqMan probe and sequencing, for detection of JAK2 V617F mutation. The advantages of this modified method include its ability to detect JAK2 V617F in homozygote and heterozygote conditions, and the presence of the internal digestion control.