تاثير هارمالين بر بيان ژن Dnmt1 و هيپومتيلاسيون پروموتور ژن P15 در رده سلولي لوسميك NB4

Effect of harmalin on Dnmt1 expression and hypomethylation of P15 gene promoter in NB4 leukemic cell

سابقه و هدف متيلاسيون DNA در ناحيه پروموتر ژنهاي سركوبگر تومور از جمله P15 ، به عنوان يكي از مهمترين مكانيسمهاي ايجاد بدخيمي هاي خوني مطرح است .هارمالين يكي از آلكالوئيدهاي مشتق شده از گياه اسپند است كه داراي خاصيت آنتي پروليفراتيو بر روي رده‌هاي سلولي لوسميك مي باشد. در اين مقاله تاثير هارمالين بر كاهش بيان ژن Dnmt1 و هيپو متيلاسيون ناحيه پروموتر ژن P15 در رده سلولي NB4 مورد بررسي قرار گرفت. مواد و روش‌ها در اين مطالعه تجربي با استفاده از روش MTT ، تاثيرات سيتوتوكسيك بر رده سلولي NB4 تا 72 ساعت بررسي شد. جهت بررسي چرخه سلولي پس از تيمار با هارمالين، از روش فلوسيتومتري استفاده شد. وضعيت متيلاسيون پروموتور ژن P15 با استفاده از روش Methylation specific PCR بررسي شد. با استفاده از روش Real-time PCR ، ميزان بيان ژن‌هاي Dnmt1 و P15 بررسي گرديد. يافته‌ها نتايج نشان داد كه داروي هارمالين از غلظت µg/mL 15 به بالا، پس از 48 ساعت به صورت وابسته به دوز و زمان داراي خاصيت آنتي‌پروليفراتيو بر روي رده سلولي NB4 مي‌باشد. آناليز چرخه‌ سلولي نشان‌ دهنده ايست سلول‌ها در فاز G0G1 است. هارمالين در غلظت ‌ µg/mL15 موجب كاهش بيان ژن Dnmt1 ، هيپو متيلاسيون پروموتور ژن‌P15 و افزايش مجدد بيان ژنP15 در رده سلولي NB4 مي شود. نتيجه گيري با توجه به اثر بخشي داروي هارمالين بر كاهش بيان ژن Dnmt1 و هيپو متيلاسيون پروموتور و افزايش بيان ژن P15 در اين رده سلولي، مي‌توان چنين پيشنهاد كرد كه اين دارو مي‌تواند به عنوان يك راه‌كار درماني مناسب به صورت‌ منوتراپي و يا داروي مكمل همراه با دارو‌هاي متداول لوسمي پروميلوسيتيك حاد مورد استفاده قرار گيرد.

Background and Objectives One of the most important mechanisms of hematologic malignancies is DNA methylation in the promoter region of tumor suppressor genes such as P15. Harmalin is one of the alkaloids derived from plants that show anti-proliferative activity on leukemic cell lines. The effect of harmalin on Dnmt1 gene expression and hypomethylation of P15 promoter in NB4 cell line was evaluated. Materials and Methods In this experimental study, cytotoxic effects of harmaline were investigated until 72 hours on the NB4 cell line using MTT. Flow cytometry was performed in order to evaluate the cell cycle of NB4 cell line after treatment with harmalin. Gene promoter methylation status of P15 was evaluated by Methylation Specific PCR. Dnmt1 and P15 gene expression was analyzed by Real-time PCR technique. Results 15μg/ml harmalin after 48 hours showed a dose and time-dependent anti-proliferative properties on NB4 cell line, cell cycle analysis would stop NB4 cells in G0G1 phase of the cell cycle. Real-time PCR results showed that 15μg/ml harmalin reduced gene expression of Dnmt1, induced hypomethylation of P15 gene promoter and increased P15 gene expression in NB4 cell line. Conclusions According to our data, the effect of harmalin on reduction of Dnmt1 expression, P15 promoter hypomethylation and P15 reactivation in this cell line showed that it could be suggested as a therapeutic strategy, suitable for monotherapy or supplement for medication which is commonly used for APL (Acute Promyeloid Leukemia).