تأثير كيفي هم كشتي سلول‌هاي كيسه زرده با رده سلولي M2-10B4 در حضور و غياب اريتروپويتين بر تمايز آن‌ها به رده اريتروئيدي

Quality effect of co-culturing of yolk sac cells with M2-10B4 line on their differentiation in the presence and absence of erythropoietin

سابقه و هدف سلول‌هاي بنيادي خون‌ساز كيسه زرده به علت تكثير زياد و نداشتن آنتي‌ژن‌هاي وابسته به MHC براي مطالعات هماتوپويتيك مناسب‌تر هستند. با توجه به اثرات مثبت استفاده از سيستم هم كشتي در تمايز سلول‌‌هاي بنيادي، در اين تحقيق سعي شد از رده سلول M2-10B4 به همراه اريتروپويتين براي تمايز سلول‌هاي بنيادي كيسه زرده استفاده شود. مواد وروش‌‌ها كيسه زرده از موش‌‌هاي حامله 10 روزه جدا گرديد و با استفاده از سرنگ و سرسوزن‌‌هاي مختلف ( G 19، G 23 و G 27) و آنزيم كلاژناز 10/1% و يا تريپسين 0/25% داراي EDTA 0/02% به سلول‌‌هاي منفرد تبديل شدند. سپس از سلول‌هاي رده M2-10B4 كه فعاليت ميتوزي آن‌ها با ميتومايسين متوقف شده بود براي هم كشتي استفاده شد و به محيط كشت حاوي ng/ml 5 0 فاكتور سلول بنيادي و U/ml 1 اريتروپويتين اضافه و در 37 درجه سانتي‌گراد و فشار 5 درصد CO2 نگهداري شد . بعد از گذشت يك هفته رشد و تمايز سلول‌‌ها ، بررسي و سنجش كلني در محيط نيمه جامد و رنگ آ ميزي بنزيدين صورت گرفت. يافته‌‌ها سلول‌‌ها برروي اين رده سلولي به‌خوبي رشد و تكثير ‌يافتند. البته در محيط حاوي اريتروپويتين، رشد بهتري نسبت به محيط فاقد آن صورت گرفته بود وسلول‌‌هاي بنزيدين مثبت يا رده اريتروئيدي يبيشتري مشاهده‌ شد. نتيجه گيري مي‌توان با انتخاب لايه پشتيبان مثل سلول‌‌هاي استرومايي مغز استخوان و به‌كار بردن هورمون اريتروپويتين، درصد بيشتري رده اريتروئيدي به دست آورد، گرچه براي تعيين نوع خون سازي اوليه يا ثانويه نيازبه انجام تحقيقات تكميلي است.

Background and Objectives The embryonic yolk sac cells have two unique characteristics: high proliferative capacity and lack of MHC associated antigen. According to the positive effects of co-culturing system on the differentiation of stem cells, in this study we evaluate the effect of M2-10B4 stromal cell line and erythropoietin (EPO) on the differentiation of embryonic yolk sac cells to erythroid cells. Materials and Methods The yolk sacs were dissected from 10-day mice and their cells were separated using syring needles and enzyme digestions (0.1% collagenase/20 fetal calf serum (FBS) or 0.25% trypsin – 0.02% EDTA at 37C). The M2-10B4 stromal cells were cultured in the DMEM medium and mitotically inactivated using mitomycin C. These cells were co-cultured with yolk stem cells in the medium containing stem cell factor (50 ng/ml); EPO (1U/ml) and the colony assay of these cells (5104 cells/ml) have been done in the presence of interleukin-3 (40 ng/ml), stem cell factor (50 ng/ml) and EPO (1U/ml) in semisolid medium. After 7 days, benzidine staining on the colonies was carried out and positive benzidine colonies were considered as erythroid colonies. Results The colony assay showed that in the presence of EPO the growth of erythroid colonies were better than the other group and they had more benzidine colonies and cells. Conclusions By using the stromal feeder layer such as bone marrow stromal cells and erythropoietin the differentiation and proliferation of YSC was improved; however, further studies are needed.