همسانه سازي، بهينه‌سازي شرايط بيان، تخليص و ارزيابي خواص ايمونولوژيك بخش هيدروفيليك آنتي‌ژن Core ويروس هپاتيت C، ابراز شده تحت پروموتر T7-araBAD در E.coli

Cloning, optimization of expression condition, purification and immunological characterization of hydrophilic section of HCV core promoter in E.coli Ag, expressed by T7-araBAD

آنتي‌ژن Core ويروس هپاتيت C ، يك پروتئين چندكاره با ارزش‌هاي ويژه در اهداف تشخيصي و تحقيقات پاتوفيزيولوژيك مي‌باشد. اكثر اين خواص مربوط به بخش هيدروفيل (آمينو اسيد: 122-2) اين آنتي‌ژن بوده و دسترسي به روشي براي توليد مقادير انبوه از اين پروتئين در فرم خالص و طبيعي، از اهميت به سزايي برخوردار است. به اين جهت با هدف همسانه‌‌سازي (كلونينگ ژن)، ابراز پروتئين با بازدهي بالا، تخليص در فرم طبيعي و ارزيابي خواص ايمونوژنيك اين بخش از پروتئين Core ويروس هپاتيت C در يك سيستم پروموتري T7 تحت القا آرابينوز، مطالعه حاضر صورت پذيرفت. مواد وروش‌ها در اين مطالعه تجربي، از روش PCR براي جداسازي ژن و از حامل pIVEX2.3 جهت كلونينگ ژن با استفاده از روش‌هاي مهندسي ژنتيك استفاده شد. آناليزهاي پروتئين توسط SDS-PAGE ، وسترن بلات و اليزا بر روي سرم بيماران HCV مثبت انجام شد و تخليص پروتئين به روش كروماتوگرافي جذبي بر روي نيكل (Ni-NTA) صورت پذيرفت. يافته‌ها ژن مربوط به بخش هيدروفيل HCV Core با موفقيت و با ترادف صحيح، جداسازي و به‌طور مناسب در كاست بياني كلون گرديد. سيستم القا آرابينوز به‌طور مؤثر، پس از 3 ساعت، قابليت توليد پروتئين نوتركيب با بازدهي mg/L 3/5 را داشته و پروتئين توليد شده به سهولت و دريك مرحله قابليت تخليص شدن تاحدود 80 درصد بر روي ستون جذبي Ni-NTA را دارا مي‌باشد. پروتئين خواص آنتي ژنيك خود را در ساختمان طبيعي حفظ مي‌نمايد. نتيجه گيري در اين مطالعه براي اولين بار نشان داده شده كه سيستم القا آرابينوز به‌طور مؤثر، قابليت كاربرد در توليد بخش هيدروفيل پروتئين Core را دارد و پروتئين تخليص شده، احتمالاً در شرايط طبيعي از لحاظ ايمونولوژيك، قابليت كاربرد براي اهداف تحقيقي و تشخيصي را داراست.

Background and Objectives The capsid or core Ag of Hepatitis C virus is a multifunctional protein which has the principal pathogenesis and diagnostic role in HCV related infections and most of these properties are attributed to the hydrophilic section (amino acids 1-122) of this protein. For different research and diagnostic applications, high amounts of this protein in pure and original form are required. So, the aim of this study was to clone the gene, optimize the expression condition, purify it in the original form, and immunologically characterize hydrophilic section of HCV Core Ag, expressed by T7-araBAD promoter system in E.coli. Materials and Methods The PCR amplified region corresponding to 2-122 section of this Ag from genotype Ib was cloned in pIVEX 2.3, a T7 promoter derived vector. The proper construct after digestional analysis and sequencing confirmations was transformed into BL21-AI E.coli, and protein expression under control of araBAD promoter by addition of 0.2% Arabinose was induced. Results After optimization of expression condition, purification of protein by NI-NTA agarose gel chromatography in native condition by immidazole yielded about 3.5mg/L of HCV core Ag. Immunological studies by western blotting through application of core specific mAbs and results of ELISA tests indicated that the protein is with desired immunological properties. Conclusions AraBAD promoter can be perfectly utilized to produce the hydrophilic section of HCV core in high yields, and purification through NI-NTA in native condition may provide the antigen for different research and diagnostic applications.