زيرهمسانه‌سازي و بيان ژن ممزوجي M‌L1-stxB دارواش در E. Coli و توليد آنتي‌بادي آن در موش سوري

Subcloning and Expression of ML1-stxB Fusion Gene of Mistletoe Lectin in E. coli and Production of its Antibody in Mouse

زمينه و هدف: عصاره برگ‌هاي دارواش (Viscum album L) داراي پروتئين MLI از نوع RIP2 (پروتئين‌هاي غيرفعال ريبوزومي تيپ 2) با خواص لكتيني هستند. STxB شيگا توكسين به‌عنوان يك ايمونواجوانت و حامل، مطرح بوده و به گيرنده سطح سلولي خود به‌نام Gb3 متصل مي‌گردد كه روي اكثر سلول‌هاي بدن بيان مي‌شود. در اين مطالعه، بيان آنتي‌ژنML1-stxB در E. coli و توليد آنتي‌بادي آن در موش سوري بررسي گرديد. روش بررسي: در اين مطالعه تجربي، پلاسميد pUC57 حاوي ژن MLI با جايگاه‌هاي آنزيمي NdeI و SalI در وكتور بياني pET28a(+)-stxB، زيرهمسانه‌‌سازي شد و به باكتري E. coli سويه (BL21(DE3 تراريخت (ترانسفورم) گرديد. بيان كاست ژني MLI-StxB تحت القايIPTG انجام گرفت. پس از تخليص، پروتئين نوتركيب MLI-STxB به‌وسيله ستون نيكل كروماتوگرافي در چهار نوبت متوالي به موش‌هاي سوري تزريق شد. يافته‌ها: در اين مطالعه، ژن ML1-stxB كلون‌شده در وكتور بياني pET28a(+)، با واكنش PCR و آناليز آنزيمي تأييد گرديد. همچنين پروتئين نوتركيب توليدشده به‌وسيله SDS-PAGE و لكه‌گذاري وسترن مورد تأييد قرار گرفت، سپس آنتي‌بادي توليدشده از سرم موش جداسازي و با روش تست ELISA بررسي گرديد. نتيجه‌گيري: براساس نتايج اين مطالعه، پروتئين ML1 داراي خاصيت غيرفعال‌كننده ريبوزومي و STxB نقش ياوري و حاملي دارد؛ لذا اين پروتئين نوتركيب، كانديداي واكسن عليه سم دارواش شيگلا ديسانتري بوده كه از آنتي‌بادي آن مي‌توان به‌عنوان شناساگر استفاده كرد.

Background and Objectives: Extract of mistletoe lectin (Viscum album L) leaves contains MLI protein that is a type 2 ribosome-inactivating protein (RIP2) with lectin properties. Shiga toxin (STxB) has been considered as an immunoadjuvant and carrier, which binds to its cell surface receptor, Gb3, that is expressed on most of the body cells. In this study, the expression of ML1-stxB antigen and production of its antibody, were investigated in mouse. Methods: In this experimental study, ML1 gene containing pUC57 plasmid with enzymes sites of NdeI and SalI, was subcloned in the pET28a(+)-stxB expression vector, and then was transformed into E. coli BL21 (DE3). The expression of ML1-stxB gene cassette was induced by IPTG. After purification, the MLI–STxB recombinant protein was purified by nickel affinity chromatography and injected into mice four times. Results: In this study, the cloned ML1-stxB gene in expression vector of pET28a(+) was confirmed by PCR and enzyme analysis. The produced recombinant protein were confirmed by SDS-PAGE and Western blotting. Then, the produced antibody was isolated from the serum of mouse and investigated using ELISA method. Conclusion: According to this study, ML1 protein has ribosome inactivating property and STxB has adjuvant and carrier functions, therefore,this recombinant protein can be a candidate vaccine against ML-1 toxin of Shigella dysentery, which its antibody can be used as identifier.