بررسي اثر آنتي‌بادي‌هاي منوكلونال ضد پلاسمينوژن انساني A5E10 ,A4D10 و A3B2 بر سيستم فيبرينوليز

Evaluation of the effect of antihuman plasminogen monoclonal antibodies of A4D10, A5E10 and A3B2 on the activation of fibrinolytic system

سابقه و هدف اصلي‌ترين تركيب سيستم فيبرينوليز، پيش‌آنزيم پلاسمينوژن مي‌باشد كه توسط فعال‌كننده‌هاي مختلفي به فرم فعال خود يعني آنزيم پلاسمين تبديل شده و نقش حياتي خود را كه همانا ليز لخته‌هاي فيبريني است ايفا مي‌كند. نخستين آنتي‌بادي منوكلونال ضد پلاسمينوژن انساني در سال 1982 توسط پلوپليس تهيه و اثر آن مطالعه شد. از آن ‌زمان‌ تاكنون ‌محققين ‌متعددي‌ در نقاط‌ مختلف‌ دنيا ‌به ‌تهيه ‌و مطالعه‌ آنتي‌بادي‌هاي ‌ضد پلاسمينوژن همت‌گماشته‌اند كه‌ حاصل‌ تحقيقات‌آن‌ها قابل‌ توجه ‌بوده ‌و زواياي‌ تاريكي ‌از دانش‌ ما را در مورد ساختمان ‌و مكانيسم ‌فعال‌شدن پلاسمينوژن، ‌وضعيت‌ فيزيولوژيك ‌فيبرينوليزو غيره روشن ساخته‌اند. در اين تحقيق، اثرات احتمالي سه آنتي‌بادي منوكلونال ضد پلاسمينوژن انساني A4D10, A5E10 و A3B2 بر سيستم فيبرينوليز و مكانيسم احتمالي اثر آن مورد مطالعه قرار گرفت. مواد و روش‌ها پس از طي مراحلي نظير كشت سلول‌هاي هيبريدوماي توليد كننده آنتي‌بادي، تزريق اين سلول‌ها به صفاق موش، تهيه آسيت و تخليص آنتي‌بادي‌ها از آن، با روش‌هاي مختلفي از جمله ارزيابي چشمي ليز لخته پلاسمايي در حضور آنتي‌بادي‌ها، اندازه‌گيري كمي قطعات DD/E به روش آزمون D ـ دايمر، ارزيابي به روش اليزا با استفاده از سوبستراي سنتتيك S-2251 و غيره اثر اين آنتي‌بادي‌ها بررسي شد. يافته‌ها مشاهدات اوليه با استفاده از پلاسماي پولد انساني نشان داد كه دو آنتي‌بادي A5E10 و A4D10 در حضور فعال‌كننده‌هاي پلاسمينوژن t-PA ، u-PA و SK ، فعاليت سيستم فيبرينوليز را افزايش مي‌دهند در حالي‌كه آنتي‌بادي A3B2 در حضور اين فعال‌كنند‌ه‌ها تأثيري بر سرعت فيبرينوليز ندارد. براساس نتايج به‌دست آمده از اندازه‌گيري كمي قطعات DD/E به روش آزمون D ـ دايمر، اثر افزايشي آنتي‌بادي‌هاي A4D10 و A5E10 به‌صورت وابسته به دوز است. در آزمون ديگري كه توسط سوبستراي سنتتيك S-2251 انجام گرفت مشخص شد كه فعال شدن پلاسمينوژن در حضور اوروكيناز و در نتيجه شكسته شدن اين سوبسترا در حضور آنتي‌بادي‌هاي A5E10 و A4D10 افزايش مي‌يابد. به علاوه بي‌اثر بودن آنتي‌بادي A3B2 بر فعال شدن پلاسمينوژن در اين آزمون نيز تأييد شد. نتيجه‌گيري احتمالا آنتي‌بادي‌هاي A4D10 و A5E10 با باز كردن فرم ساختاري پلاسمينوژن، فعال شدن آن‌ را در مقابل فعال‌كننده‌هاي پلاسمينوژن تسهيل مي‌كنند.

Background and Objectives The most important component of fibrinolytic system is the proenzyme plasminogen that through various activators is converted to its active form plasmin and performs its vital functions that is fibrin clot lysis. The first anti human plasminogen antibody was prepared by Ploplis in 1982 and its effect was studied. Since then many researchers have attempted to prepare and study anti plasminogen antibodies to elucidate important aspects of structure and activation mechanism of plasminogen , physiologic condition of fibrinolysis, etc. In the present study, we studied the probable effects of three antihuman plasminogen monoclonal antibodies A4D10, A5E10 and A2C8 on the activation of the fibrinolytic system. Materials and Methods After separate steps like the culture of antibody-producing hybridoma cells, their injection to mice, extraction of the ascites fluid and purification of antibodies were taken, various methods such as optical evaluation of plasma clot lysis in the presence of antibodies, quantitative measurement of DD/E in D-dimer assay, evaluation with ELIZA assay using S-2251 synthetic substrate lysis and the like were used to study the effects of thses antibodies. Results Primary observations with human pooled plasma showed that in the presence of plasminogen activators (t-PA, u-PA and SK), A5E10 and A4D10 can enhance activation of fibrinolytic system, but A3B2 has no effect on this system. According to D- dimer assay, it was shown that the lytic effects of A5E10 and A4D10 antibodies were dose dependent; the higher the amount of antibodies, the lower their effects. The other test performed with S-2251 synthetic substrate showed plasminogen activation in the presence of Urokinase; therefore, lysis of this substrate enhanced in the presence of A5E10 and A4D10 antibodies. Moreover, in this test ineffectiveness of A3B2 on plasminogen activation was confirmed. Conclusions In conclusion, we suggested A4D10 and A5E10 antibodies by modification of structural from of plasminogen facilitate its activation in presence of plasminogen activators.