تشخيص غير تهاجمي ژنوتايپ RhD جنين انسان از نمونه سرم مادران RhD- منفي با استفاده از Hemi-nested PCR

Non-invasive fetal RhD genotyping by hemi-nested PCR of maternal serum in RhD-negative pregnancies

سابقه و هدف آنتي‌ژن RhD در ايجاد بيماري‌هاي هموليتيك نوزادان نقش مهمي دارد و از آن‌جايي كه تعيين RhD جنين با استفاده از روش‌هاي تهاجمي مانند آمنيوسنتز، خطراتي را براي مادر و جنين به دنبال خواهد داشت، در اين پژوهش تلاش گرديد تا ژنوتايپ RhD جنين از DNA آزاد جنيني موجود در سرم مادران باردار، به صورت غير تهاجمي و با استفاده از روش Hemi-nested PCR تعيين گردد. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربي (experimental) بود. نمونه‌هاي خون 45 مادر باردار RhD - منفي كه همسر RhD - مثبت داشتند جمع‌آوري شد و DNA آزاد سرم آن‌ها با روش فنل كلروفرم استخراج گرديد. با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي و در دو دور PCR ، قطعه‌اي از اگزون 10 ژن RhD تكثير شد. براي تاييد نتايج منفي حاصله بر روي نمونه‌هاي مادران باردار حامل جنين RhD - منفي، با استفاده از آغازگرهاي اختصاصي قطعه‌اي از ژن ديگري به نام RhCE تكثيرگرديد. يافته‌ها پس از تولد، پيگيري انجام شده در رديابي نتايج سرولوژيكي بند ناف نوزادان و ارزيابي نتايج حاصل از اين پژوهش مشخص نمود كه در 37 مورد از 41 نمونه قابل پيگيري، RhD جنين به ميزان 95/45% به درستي تعيين شده ‌است. نتايج مربوط به 4 نمونه باقيمانده شامل يك مورد منفي كاذب و سه مورد مثبت كاذب بوده‌ است. نتيجه گيري اين پژوهش نشان داد كه براي تشخيص پيش از تولد گروه خوني RhD جنين به روش غير تهاجمي و با كمترين احتمال خطر براي نوزاد، نمونه‌هاي سرمي مادران بسيار مناسب است. در اين ارتباط استفاده از روش‌هاي جديد و حساس مولكولي مانند روش Hemi-nested PCR و به دست‌آوردن درصد بالايي از ميزان تشخيص ژنوتايپ RhD اين اميدواري را به ارمغان مي‌آورد كه با حذف تمام عوامل مداخله‌گر و تكميل اين روش، مي‌توان اين تشخيص را با اطمينان بالايي در كلينيك به كار برد.

Background and Objectives RhD antigen has an important role in causing hemolytic diseases in newborns; in testing fetal RhD status by an invasive method such as amniocentesis, it would also harm the fetus and mother. This study tried to detect fetal RhD genotype using free fetal DNA in maternal serum by a noninvasive method using hemi-nested PCR. Materials and Methods Blood samples were collected from 45 RhD- negative pregnant women whose spouses were Rh-positive; the women's serum free DNAs were isolated by Phenol-Chloroform method. The exon 10 of the RhD genes was amplified in two rounds of PCR using special primers. For confirmation of negative results obtained in the second PCR, the fragment of the RhCE gene was amplified using special primers. Results Follow up and evaluation of the PCR results and relevant serological analysis of cord blood after delivery revealed that in 37 out of 41 cases the RhD had been determined appropriately (95.45%). There were one false-negative and three false-positive cases. Conclusions This study showed that maternal serum is very suitable for prenatal diagnosis of fetal RhD using noninvasive methods with minimum risk for neonates. In this regard, modern molecular methods with high sensitivity such as hemi-nested PCR and elimination of interfering factors could be applicable in clinical approaches.