ارزيابي پيوند هم‌زمان سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي انساني و سلول‌هاي CD34+ خون بند ناف به موش Balb/c اشعه ديده با روش سنجش كلوني طحال CFU-S

Evaluation of cotransplantation of human mesenchymal stem cells and umbilical cord blood CD34+ cells with CFU-S assay

سابقه و هدف خون بند ناف حاوي تعداد زيادي سلول‌هاي پيش‌ساز ابتدايي است كه براي پيوند باليني استفاده مي‌شوند ولي درصد موفقيت پيوند اين سلول‌هاي بنيادي پايين است. لذا در اين مطالعه سلول‌هاي CD34+ هم‌زمان با سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي (MSC) به موش‌هاي Balb/c اشعه ديده، پيوند زده شد و نتايج به صورت شمارش تعداد كلون در سطح طحال ارزيابي گرديد. مواد وروش‌ها مطالعه انجام شده از نوع تجربي بود. نمونه‌گيري به روش تصادفي انجام شد. سلول‌هاي CD34+ خون بند ناف انساني از نمونه خون بند ناف به روش ايمونومگنتيك و MSC از مغز استخوان طبيعي انسان جدا شد. MSC از نظر ماركرهاي سطحي CD166 و CD105 و درصد خلوص سلول‌هاي CD34+ با فلوسايتومتري ارزيابي شد. سلول‌هاي CD34+ با دوز ^6^10× 0/2 تا 1 به طور هم‌زمان با MSC با دوز ^6^10×0/25 تا 1 به موش 6 تا 8 هفته‌اي اشعه ديده( Gy 7) پيوند شد. پس از گذشت 11 روز، تعداد كلون‌ها در سطح طحال شمارش و به روش هماتوكسيلين و ائوزين (H&E) رنگ‌آميزي شد. جهت ارزيابي وجود سلول‌هاي CD34+ انساني در كلون موجود در طحال، اين سلول‌ها با ذرات آهن (SPIO) نشان‌دار شده و به موش اشعه ديده تزريق شدند. طحال اين گروه به روش آبـي پروس رنگ‌آميزي شد. در آناليز آماري جهت بررسي تعداد كلون از آزمايش كروسكال ـ واليس با نرم‌افزار SPSS استفاده شد. يافته‌ها ارزيابي فلوسايتومتري، درصد سلول‌هاي تهيه شده از خون بند ناف و مغز استخوان را براي سلول‌هاي بنيادي CD34+ حدود 90% و MSC را بيش از 96% نشان داد و 100 درصد سلول‌ها زنده بودند. تعداد كلون‌هاي طحال در پيوند هم‌زمان دوزهاي ^5^10×3 و 2 CD34+ و دوزهاي ^6^10×1 و 0/5 MSC به طور معني‌دار در مقايسه با ساير گروه‌ها افزايش يافت( (p<0.01). گرانول‌هاي آهن با رنگ‌آميزي آبي پروس در كلون‌هاي طحال مشاهده شد. نتيجه گيري سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي باعث تسريع پيوند سلول‌هاي CD34+ مي‌شود و استفاده از پيوند هم‌زمان سلول‌هاي بنيادي خون بند ناف به همراه سلول‌هاي بنيادي مزانشيمي مي‌تواند موفقيت پيوند سلول‌هاي بنيادي را افزايش دهد.

Background and Objectives Umbilical cord blood (UCB) contains a high number of primitive progenitor cells for transplantation. However, the rate of UCB CD34+ stem cell engraftment is low. In this study we examined the effect of human MSCs (mesenchymal stem cell) on engraftment of human UCB-derived CD34+ cells in irradiated Balb/c mice. Materials and Methods Human UCB CD34+ cells were obtained from full-term normal deliveries by immunomagnetic techniques and MSCs were isolated by a standard methodology from bone marrow aspirates. Isolated MSCs were evaluated for cell-surface antigens of CD166 and CD105 by flowcytometry. The absolute count of CD34+ UCB stem cells was also determined by flowcytometry. Irradiated (7 Gy) Balb/c mice were transplanted intravenously with 0.2 to 1.0 × 106 human UCB CD34+ cells in the presence or absence of 0.25 to 1 × 106 human bone marrow-derived MSCs. The mice in every group on day 11 after transplantation were killed and their spleen dissected. In every group, colony assay and H and E staining were performed. To make sure of the presence of human stem cells in spleen colonies, UCB CD34+ cells were labeled with super paramagnetic iron oxide (SPIO) before transplantation. The colonies in spleen then underwent Prussian blue staining. In the statistical analyis, Kruskal-Wallis test using SPSS software was employed to determine the number of colonies. Results Flowcytometry assay showed that after purification, 90% of the cells were CD34+ and 96% marker positive for MSCs. Viablity of cells was 100%. Cotransplantation of low doses of UCB CD34+ cells (0.2 and 0.3 × 106) and MSC (0.5 and 1 × 106) resulted in a significant increase of the number of colony forming units spleen, in comparison with the engraftment of UCB CD34+ stem cells without MSC after 11 days (p<0.01). Prussian blue staining showed the Fe+2 granules in UCB stem cells. This indicated that cells in the colonies were engrafted UCB CD34+ stem cells. Conclusions The results showed that cotransplantation of MSC with UCB CD34+ cells promotes engraftment of UCB CD34+ cells.