بيان و تخليص پروتئين كايمر نوتركيب دربردارنده CtxB و TcpA از ويبريوكلرا و بررسي تيتر آنتي بادي در موش

Expression and purification of recombinant chimeric protein contains CtxB and TcpA from Vibrio cholera and investigation of antibody titer in mouse

هدف: عامل كلونيزاسيون پيلي tcpa و توكسين كلرا مهم ترين عوامل بيماريزايي ويبريو كلرا هستند و توانايي تحريك سيستم ايمني را دارند. هدف از اين تحقيق بررسي بيوانفورماتيكي، بيان پروتئين كايمر نوتركيب CTXB -TCPA در باكتري اشريشيا كلي و توليد آنتي بادي عليه آن در موش بود. مواد و روش ها: كاست ژني دربر دارنده ژن هاي tcpA ، chB و فاصله انداز با روش بيوانفورماتيكي طراحي شد. شاخصه هايي از قبيل ساختار پروتئين كايمر و اپي توپ ها بررسي شد. براي ساخت كاست ژني، ژن هاي ctxB و fcpa تكثير و در ناقل pET 28a همسان سازي شدند. بيان ژن هاي ctsB -tcpA در (+)pET 28a تحت القاي IPTG انجام شد. پروتئين نوتركيب CTXB - TCPA به روش SDS - PAGE و لكه گذاري وسترن تأييد شد. تيتر آنتي بادي توليد شده در سرم موش با روش الايزا بررسي شد. نتايج: شاخص انطباق پذيري در ژن بهينه سازي شده به 0/9 تغيير كرد. با بهينه سازي ژني درصد كدون هاي با ترجيح بالا به 74 درصد افزايش يافت. تحليل آنزيمي همسان سازي كايمر ژني ctsB -tcpa در ناقل بياني (+)pET28a را تأييد كرد. پروتئيني با وزن مولكولي 35 كيلو دالتون در SDS - PAGE ديده شد. واكنش پروتئين با آنتي بادي ضد سم كلرا در وسترن بلات تأييد شد. ميزان پروتئين خالص شده 33/1 ميلي گرم در ليتر بود. ايمن سازي موش ها پاسخ آنتي بادي سرمي را القا كرد. نتيجه گيري: پروتئين كايمر مي تواند براي بررسي هاي ايمني عليه و با در نظر گرفته شود.

Objective: The TcpA colonization factor of pili A and the cholera toxin are the most important pathogenesis factors of Vibrio cholera that have the ability to stimulate the immune system. The aim of this study is a bioinformatics analysis of the expression of CtxB-TcpA recombinant chimeric protein in E. coli, and production of antibody against it in mice. Methods: We designed a gene cassette that contained the CtxB and TcpA genes, and a spacer linker by using bioinformatics. Characteristics that include the structure of the chimer protein and epitopes were studied. In order to build a gene cassette, TcpA and CtxB genes were proliferated and cloned in pET28a(+). CtxB-TcpA gene expression was induced by IPTG. The produced CtxB-TcpA recombinant protein was confirmed by SDS-PAGE and Western blot analyses. Antibody produced from mice serum was isolated and confirmed by ELISA. Results: The codon adaptation index of the optimized gene was 0.9. The prevalence ratio codons increased to 74% through codon optimization. Enzyme analysis verified the chimeric gene CtxB-TcpA cloning in the pET28a (+) expression vector. A protein with a molecular weight of 35 kDa was seen on SDS-PAGE. Its reaction with anti-histidine antibodies was confirmed by Western blot. The purified protein was 33.100 mg/l. Immunization of mice induced a serum antibody response. Conclusion: The chimeric protein can be considered a good candidate for effective immunity against cholera.