همسانه سازي، بيان و خال صسازي اورا تاكسيداز نو تركيب با استفاده از توالي اينتئين و پروتئين شبه الاستين

Cloning, Expression, and Purification of Recombinant Urate Oxidase Using Intein Sequence and Elastin-like Protein

اهداف: بيان و خالص‌سازي اورات‌اكسيداز نوتركيب همانند ساير پروتئين‌هاي دارويي مستلزم صرف هزينه‌هاي زيادي است. استفاده از روش‌هاي غيركروماتوگرافي در فرآيند خالص‌سازي مي‌تواند سبب كاهش هزينه‌هاي توليد شود. بنابراين، هدف پژوهش حاضر، همسانه‌سازي، بيان و خالص‌سازي اورات‌اكسيداز نوتركيب با استفاده از توالي اينتئين و پروتئين شبه‌الاستين بود. مواد و روش‌ها: در پژوهش تجربي حاضر، ژن صناعي اورات‌اكسيداز در پايين‌دست توالي اينتئين و پروتئين شبه‌الاستين در پلاسميد بياني قرار داده شد. بعد از كشت باكتري حاوي پلاسميد بيان‌كننده اورات‌اكسيداز، سلول‌ها ليز و محتوي پروتئين محلول از غيرمحلول به‌وسيله سانتريفوژ جدا شد. با افزودن نمك به بخش محلول حاوي اورات‌اكسيداز و در دماي Cº37، آنزيم مورد نظر رسوب داده شد. با انحلال رسوب در بافر خاص برش و به‌واسطه حضور توالي اينتئين، اورات‌اكسيداز توليدشده از پروتئين شبه‌الاستين جدا شد. با افزودن مجدد نمك در دماي Cº37 پروتئين شبه‌الاستين رسوب و اورات‌اكسيداز در محلول باقي ماند. پس از بيان و خالص‌سازي اورات اكسيداز، ميزان خلوص و فعاليت زيستي آن مورد ارزيابي قرار گرفت و با داروي استاندارد مقايسه شد. يافته‌ها: آنزيم اورات‌اكسيداز نوتركيب به‌صورت فيوژن با توالي كدكننده اينتئين و پروتئين شبه‌الاستين بيان و خالص شد. ميزان خلوص 90% در اين روش حاصل شد كه معادل 1/89 ميلي‌گرم در ميلي‌ليتر پروتئين بود. ميزان مذكور معادل 1/64 ميلي‌گرم براساس فعاليت آنزيمي بود. نتيجه‌گيري: استفاده از توالي اينتئين و پروتئين شبه‌الاستين به‌ صورت همراه با آنزيم اورات‌اكسيداز به بيان و خالص‌سازي اين آنزيم بدون نياز به روش كرماتوگرافي كمك مي‌كند.

Aims Expression and purification of recombinant Urate oxidase as well as other pharmaceutical proteins are a costly process. The use of non-chromatographic methods in the purification process can reduce production costs. So, the aim of this study was cloning, expression, and purification of recombinant urate oxidase, using intein sequence and elastin-like protein (ELP). Materials & Methods In the present experimental research, the synthetic urate oxidase gene was cloned in downstream of ELP–Intein in an expression plasmid. After cultivating bacteria containing urate oxidase expression plasmid, the soluble fraction of cell lysate was separated from insoluble portion, using centrifugation. The recombinant urate oxidase was precipitated by adding salt and incubation at 37°C. The resulting precipitant was resuspended in cleavage buffer and the urate oxidase was separated from ELP through Intein moiety. Adding salt for the second time and incubation at 37°C resulted in separation of urate oxidase from fusion partner. After expressing and purifying the urate oxidase, purity and biological activity of recombinant urate oxidase were compared to standard drug. Findings The recombinant urate oxidase was expressed and purified using ELP and Intein tags as fusions partners. The rescombinant enzyme showed a purity of %90 equal to 1.89 mg.ml-1 based on protein concentration and 1.64 mg.ml-1 based on activity. Conclusion Using Intein sequence and Elastin-like protein, together with the Urate Oxidase enzyme helps to express and purify the enzyme without need for a chromatographic method.