طراحي روش غربالگري سريع چهار جهش شايع ژن بتاگلوبين در جمعيت ايران با استفاده از روش منحني ذوب با تفكيك بالا

Designing a Rapid Screening Method for Detection of Four Common Beta Globin Gene Mutations in Iranian Population by High-Resolution Melting Analysis

اهداف: تالاسمي بتا، يك بيماري خوني و ژنتيكي است، شيوع ناقلين اين بيماري در جمعيت ايران بالاست. بررسي غربالگري قبل از ازدواج براي تعيين ناقلين تالاسمي بتا، به تشخيص سريع و قابل اعتماد نياز دارد. هدف پژوهش حاضر طراحي روش غربالگري سريع چهار جهش‌ شايع ژن بتا گلوبين جمعيت ايران با استفاده از روش ذوب با تفكيك بالا (HRM) بود. مواد و روش‌ها: در مطالعه تجربي حاضر هشت نمونه از افراد مبتلا و ناقل تالاسمي بتا با ژنوتيپ‌هاي IVSI-5) ،IVSII-I (G> A) ،IVSI-110 (G>A) CD36/37 (-T) و (G>C) در شرايط هموزيگوت و هتروزيگوت و يك نمونه كنترل (فرد سالم) انتخاب شدند. بعد از گرفتن خون، استخراج DNA با روش نمكي انجام شد. براي اطمينان، نمونه‌ها به‌صورت دوتايي ران شدند و دو نمونه كنترل بدون DNA نيز به‌كار رفت. آغازگرها، با كمك نرم‌افزارهاي Gene Runner 6.0.28، Primer Express v 3.0.1 3/1) و Primer3 v. 0.4.0 طراحي شدند و روش HRM براي تعيين جهش‌هاي فوق به‌كار رفت. يافته‌ها: بهترين غلظت مناسب DNA، 5نانوگرم بر ميكروليتر به‌دست آمد. در مرحله تفاوت نمودار به‌وضوح تفاوت منحني‌ها در شرايط هتروزيگوت، نرمال و هموزيگوت مشاهده شد. در جهش IVSII-IG>A در منحني ذوب برخلاف انتظار دو قله در نمونه‌ها ديده شد، علت آن حضور يك پلي‌مورفيسم در نزديكي جهش بود. نتيجه‌گيري: روش HRM قابليت تشخيص چهار جهش شايع ژن بتاگلوبين را دارد و مي‌تواند بين فرد هتروزيگوت و هموزيگوت و فرد سالم نيز در يك جهش واحد افتراق ايجاد كند. روش HRM توان بالايي داشته و مي‌تواند 96 نمونه DNA را در مدت دو ساعت آناليز كند.

Aims Beta-thalassemia is a blood and genetic disorder. Prevalence of beta-thalassemia trait is high in Iranian population. Therefore, for detection of carriers’ status in premarital screening we need to establish reliable and rapid scanning method. The aim of this study is development a rapid method to detect four common beta globin gene mutations in Iranian population by HRM (High-Resolution Melting Analysis. Materials & Methods In this experimental study, eight samples of beta-thalassemic carriers and illness with IVSI-110 (G>A), IVSII-I (G>A), IVSI-5 (G>C) and CD36/37 (-T) genotypes in Homozygote and heterozygote conditions and one control sample (healthy person) were selected. After blood collection, DNA extraction was performed using salting out method. To ensure, the samples were run binary, and two control samples without DNA were used. Primers were designed with Gene Runner 6.0.28, Primer Express v 3.0.1 3/1) and Primer3 v. 0.4.0 and HRM method was used to determine the above mutations. Findings The best concentration of DNA was obtained at 5ng/μl. In the difference plot step, the differences between the curves were clearly observed in heterozygous, normal and homozygous conditions. Unexpectedly, in the mutation IVSII-IG>A in the melting curve was seen two peaks in the samples; it was due to the presence of a polymorphism near the desired mutation. Conclusion The HRM method is capable of detecting the four common beta globin gene mutations, and, it can differentiate between heterozygote and homozygous in a single mutation. This method is high throughput, which can analyze 96 samples of DNA in 2hours.