بررسي مقاومت استرپتوكيناز كايمري حاصل از جابه جايي دومين ها ميان دو گروه استرپتوك وكي نسبت به آلفا دو آنتي پلاسمين

Evaluation of the α2-Antipalsmin-Resistance of a Domain Exchanged-Chimeric Streptokinase from Two Streptococci Groups

اهداف: أسترپتوكيناز كايمر حاصل از تبادل دومين استرپتوكيناز ميان دو سويه استرپتوكوك بناهموليتيك گروه G و A به منظور بررسي اثر دومين هاي استرپتوكيناز در مقاومت به مهاركننده آلفا دو آنتي پلاسمين ساخته شد. مواد و روش ها: در مطالعه تجربي حاضر ژن هاي استرپتوكيناز [skg / ska) تكثير شده از ژنوم دو سويه گروه A و به ترتيب SK2bALAB49 و SK2aG88 در pET26b كلون شدند. به منظور تبادل دومين، محصول PCR حاوي دومين بتا و گاماي SkALAB49 در pET26 - skG88 فاقد اين دومين ها قرار گرفت. پس از تاييد هر سه سازه با آناليز آنزيمي و توالي يابي، بيان در E. coli Rosetta انجام و پروتئين ها با كروماتوگرافي تمايلي Ni - NTA تخليص شدند. پس از تعيين غلظت، آناليز با روش الكتروفورز ژل آكريلاميد و وسترن بلات انجام شد. مقاومت به آلفا دو آنتي پلاسمين به روش رنگ سنجي با به كارگيري سوبستراي كروموژنيك S2251 اندازه گيري شد. يافته ها: نتايج الكتروفورز ژل آكريلاميد و وسترن بلات نشان دهنده بيان پروتئين ها با اندازه 47 كيلودالتون بود. در بالاترين غلظت آلفا دو آنتي پلاسمين، SK2aG88، % 80 فعاليت در حالي كه SK2bALAB49 و 55% (SKch (azacBBB2bALABY2bALAB، فعاليت اوليه خود را نشان دادند. نتيجه گيري: SKch الگوي كاهش فعاليت مشابه SK2bALAB49 را نشان مي دهد كه بيانگر نقش كمتر دومين آلفا نسبت به ساير دومين ها در بروز مقاومت به مهاركننده آلفا دو آنتي پلاسمين است

Aims The chimeric domain-exchanged streptokinase (SKch) between two sk genes from groups G and A streptococci (SK2aG88 and SK2bALAB49, respectively) was constructed to evaluate the role of SK-domains (α, β, γ) in α2-antipalsmin-resistance variations of SK. Materials & Methods In this experimental study, PCR-amplified genes of streptococci (skg, ska) were cloned into pET26b vector to produce pET26-SKG88 and pET26-SKALAB49. For domain exchange, the amplicon containing β and γ domains of SK2bALAB49 was replaced for that of the SK2aG88 within pET-SK2aG88 (pET26-SKch; α2aG88β2bALABγ2bALAB). All constructs were confirmed by restriction analyses/agarose-gel electrophoresis and DNA sequencing, transformed into E.coli Rosetta, and induced by IPTG for protein expression. Proteins were purified by Ni-NTA chromatography, quantified by Bradford method, and analyzed by SDS-PAGE/Western blotting assays. The α2-antipalsmin-resistance was measured by S2251 colorimetric assay for plasminogen activation. Findings SDS-PAGE and western blotting results indicated the expression of proteins with the size of 47kD. At the highest concentration of α2-antiplasmin, SK2aG88 remained 80% active, whereas the SK2bALAB49 and SKch retained 55% of their activity. Conclusion SKch shows similar activity reduction, indicating the minor role of the α domain compared to β and γ domains for α2-antipalsmin-resistance.