بيان ميني ژنهاي فاكتور 9 انعقادي انساني در سلول هاي كليه انسان

EXPRESSION OF THE HUMAN COAGULATION FACTOR IX MINIGENES IN CULTURED HUMAN KIDNEY CELLS

پيش زمينه و هدف نقص در عملكرد فاكتور 9 منجر به بيماري هموفيلي B مي گردد. استفاده از فرآورده هاي پلاسمايي جهت جلوگيري از خونريزي، خطر انتقال عوامل عفوني را افزايش مي دهد. بنابراين امروزه استفاده از فاكتور 9 نوتركيب، به عنوان جايگزين مناسب نوع پلاسمايي آن مطرح شده است. به منظور بيان و توليد فاكتور 9 نوتركيب، استفاده از يك وكتور بياني با توالي هاي تنظيمي سيس مناسب ازجمله توالي هاي اينتروني لازم است. مواد و روش كار 4 وكتور پلاسميدي بيان كننده فاكتور 9 كه فاقد و واجد اينترون هاي ژن بتا گلوبين (در جايگاه معادل خود در cDNA فاكتور 9 ) ساخته شدند و با روش ليپوفكشن به سلول هاي Hek-293T ترانسفكت شدند. سپس كارايي پلاسميدها در بيان فاكتور 9 با انجام آزمون الايزا بر محيط كشت سلول ها در 3 روز متوالي پس از ترانسفكشن و نيز آزمون نيمه كمي RT-PCR انجام پذيرفت. يافته ها در روز سوم پس از ترانسفكشن، بالاترين بيان فاكتور 9 از سازه ژني بدون اينترون و سازه ژني داراي اينترون 1 بتا گلوبين به دست آمد. در بيان فاكتور 9، اينترون 1 بتا گلوبين موثرتر از اينترون 2 آن بود. همچنين بر مبناي نتايج RT-PCR نيمه كمي، بالاترين ميزان mRNA از سازه ژني بدون اينترون به دست آمد. بحث و نتيجه گيري سازه هاي ژني بدون اينترون و داراي اينترون 1 ژن بتا گلوبين، كاراترين سازه ها در بيان فاكتور 9 بودند. استفاده از اينترون هاي بتا گلوبين در cDNA فاكتور 9 بيان اين پروتئين را در مقايسه با سازه ژني بدون اينترون كاهش داد. اين كاهش بيان را مي توان با احتمال، به اسپلايسينگ نادرست اينترون هاي بتا گلوبين در cDNA فاكتور 9 نسبت داد.

Background & aims: Hemophilia B is caused by either functional deficiency or lack of the human coagulation factor IX (hFIX). The current protein-based therapy with plasma-derived proteins increases, the risk of blood-borne pathogens transmission. Therefore, replacement therapy with recombinant hFIX (rhFIX) is an attractive alternative to plasma derived hFIX concentrates. In order to express and produce rhFIX protein, an efficient expression vector with suitable cis-regulatory elements such as intronic sequences is required. Materials & Methods: Four hFIX-expressing plasmids with or without human β-globin (hBG) introns (intron I and intron II) inside the hFIX-cDNA and the Kozak element were constructed and introduced into the Hek-293T cells using transfection method. Next, the efficacies of the plasmids were evaluated by performing ELISA on cultured media during 3 days of post-transfection as well as semi-quantitative RT-PCR. Results: The highest hFIX expression levels were obtained from the intron-less and intron-I containing plasmids after 3 days of transfection. The first hBG intron was more effective than the second one. Furthermore, the highest mRNA level was obtained from the intron-less construct. Conclusion: Intron-less and intron-I containing plasmids were more effective compared to other constructs for expression of hFIX. Application of the hBG intronic sequences reduced the hFIX expression levels, probably due to improper splicing of the hBG introns from the hFIX pre-mRNAs.