تخليص پروتئين نوتركيب زير واحد بتاي انتروتوكسين ويبريو كلرا

Purification of the recombinant beta subunit of Vibrio cholera entrotoxin

زمينه و هدف: زير واحد بتاي انتروتوكسين ويبريو كلرا بخش غيرسمي و پنتامريك محسوب ميشود كه اين بخش مسئول اتصال هولوتوكسين به گيرنده گانگليوزيد GM1 واقع در سلولهاي هستهدار است. در اين بررسي سعي شد زير واحد بتاي توكيسن ويبريوكلرا در سيستم پروكاريوتي توليد، تخليص و تأييد گردد. مواد و روشها: در اين مطالعه تجربي ابتدا حامل نوتركيب زير واحد بتاي توكسين ويبريوكلرا pET-28a قابل القاء در داخل سويه بياني اشرشياكلي (BL21) طراحي و ساخته شد. سپس سويه بياني تحت تأثير ايزوپروپيل- بتا- دي- تيوگالاكتو پيرانوزيد القاء و پروتئين نو تركيب زير واحد بتاي توكسين ويبريوكلرا در مقياس كوچك و بزرگ توليد شد. پروتئين نوتركيب توليد شده بااستفاده از ستون رزين نيكل پس از چند برابر شدن بدون آلودگي با زير واحد A توكسين استخراج شد. در انتها پروتئين نوتركيب زير واحد بتاي توكسين ويبريوكلرا استخراج و تخليص شده با آزمايش وسترن بلاتينگ تأييد نهايي شد. يافتهها: ميزان تخليص پروتئين نوتركيب زير واحد بتاي توكسين ويبريوكلرا با اين روش حدود 480 ميكروگرم به ازاي هر ليتر از محيط القاء شده بود. آزمايش وسترن‌بلاتينگ نيز نشان داد پروتئين نوتركيب تخليص شده به طور قوي و اختصاصي با آنتي بادي ضد انتروتوكسين ويبريو كلره واكنش ميدهد. نتيجهگيري: اشرشياكلي ميتواند ميزبان قابل دسترسي براي توليد پروتئين نوتركيب زير واحد بتاي توكسين ويبريوكلرا باشد. همچنين ميتوان از وكتور و ميزبان طراحي شده براي توليد انبوه اين پروتئين استفاده كرد.

Background: Vibrio cholera toxin B (CTB) subunit is the pentameric non-toxic portion of cholera toxin (CT) which is responsible for the holotoxin binding to the GM1 ganglioside receptor present on nucleated cells. this study was to produce, purify, and verify recombinant CTB (rCTB) subunitin prokaryotic system. Materials and Methods: In this experimental study, rCTB expression vector (pET-28a) which could be induced in E. coli (BL21) was designed and synthesized. Then the recombinant expression strains containing the result of IPTG interaction were induced and the rCTB was generated on small and large scales. The rCTB produced through Ni2+-charged resin, after refolding and free of possible CTA contaminants, was extracted. After purification, rCTB was verified by Western blotting. Results: The results indicated the level of purification to be about 480µg of purified active pentameric rCTB for each liter of the induced culture. Also, Western blotting analysis showed that recombinant CTB is strongly and specifically recognized by polyclonal antibodies against the cholera toxin. Conclusion: The findings of this study demonstrated that E.coli is an available host for production of CTB. In addition, the designed host and vector can be used in large scale production of this protein